晚期肝细胞癌（HCC）生存期短，治疗手段有限，以索拉非尼为代表的小分子靶向药物实现了晚期HCC系统性治疗的突破，但索拉非尼的疗效对于不同患者群体存在较大差异，寻找有效的疗效预测标志物进而筛选出、潜在获益人群对于临床实践具有重要意义。近日，自然（Nature）出版社旗下英国癌症杂志（British Journal of Cancer）发表的研究[1]表明，miR-10b-3p可抑制索拉非尼耐药关键分子-细胞周期蛋白E1（cyclin E1）的表达并显著增强索拉非尼诱导的肝癌细胞凋亡，血清miR-10b-3p水平较高的患者其总生存时间（OS）也明显优于低表达患者，提示miR-10b-3p可作为索拉非尼疗效预测的潜在标志物[2]。
引言
肝癌是全球范围内发病率和致死率均较高的恶性肿瘤，肝细胞癌（HCC）是肝脏恶性肿瘤的主要病理类型，占比75%以上。早期HCC如果接受规范化的手术治疗，5年生存率可达60%-80%，遗憾的是很多患者确诊时已经错失手术良机，具备手术指征的患者比例不足20%[2]。无法手术的晚期HCC患者治疗手段较为有限，整体生存时间极为不乐观。以酪氨酸激酶抑制剂为代表的靶向药物开启了晚期HCC的治疗新里程，索拉非尼（Sorafenib）是首款被美国FDA批准用于不可切除HCC一线治疗的多靶点酪氨酸激酶药物，在推动其获批的“SHARP”研究中索拉非尼相较于安慰剂延长了2.8个月的总生存期（OS），直至今日，索拉非尼依然是NCCN指南推荐的晚期HCC一线治疗药物之一[3]。然而HCC患者对于索拉非尼的药物反应存在较大差异，寻找有效的疗效预测标志物进而筛选出索拉非尼的潜在获益人群对于临床实践具有重要意义。
miRNA是一类由18-25个核苷酸构成的非编码短链单链RNA，通过和目的基因信使RNA特异性结合抑制其翻译或者诱导信使RNA降解进而达到转录后水平的基因沉默效应[4]。人体约有90%的基因表达可受miRNA调控，miRNA在包括肝癌在内的恶性肿瘤的发生发展中扮演着重要角色[5]。已证实一些特异性表达的miRNA可用早期HCC的临床诊断，还有一些miRNA可能参与了索拉非尼耐药，其在组织和血清中的表达和索拉非尼的疗效呈现出明显相关性[6]。本研究表明，miR-10b-3p可抑制索拉非尼耐药相关分子-细胞周期蛋白E1（cyclin E1）的表达并显著增强索拉非尼诱导的肝癌细胞凋亡效应，循环miR-10b-3p水平较高的患者其总生存时间（OS）也明显优于低表达患者，提示miR-10b-3p可作为索拉非尼疗效预测的潜在标志物。
正文
miR-10b-3表达水平与HCC细胞系对索拉非尼的反应具有显著相关性
研究对比了对索拉非尼敏感(Huh-7)和耐药(Huh-7R和Hep3B的)肝癌细胞系的miRNA表达谱，从中筛选出9个表达差异显著（4倍以上）的miRNAs ,并使用RT-qPCR进行验证，最终锁定了在耐药细胞株中下调最为显著的miR- 10b-3p。细胞增殖及毒性试验（MTT法）表明，索拉非尼对于肝癌细胞的IC50值和细胞的miR-10b-3p表达水平具有显著相关性，动物实验也表明，对索拉非尼耐药的荷瘤小鼠其血清和肿瘤组织中的miR-10b-3p水平也明显升高。
此外，当细胞株使用高于IC50剂量的索拉非尼处理后，细胞上清液以及细胞中的miR- 10b-3p水平均显著升高，以上结果表明miR-10b-3p可能在索拉非尼诱导肝癌细胞凋亡中发挥重要作用，且miR-10b-3p水平的高低或许和索拉非尼疗效相关（图1）。
图1
血清miR-10b-3p水平可用于判断接受索拉非尼治疗的患者预后
研究纳入了45例接受索拉非尼一线治疗的晚期HCC患者并检测了其血清miR- 10b-3p水平，此外研究将6例健康志愿者的血清miR- 10b-3p水平与之进行比较。结果表明，HCC患者的血清miR-10b-3p水平高于健康志愿者。随后研究根据血清miR-10b-3p水平将患者分为27例高表达组和18例低表达组，结果表明两组中位PFS（无疾病进展生存期）未见明显差异，但高表达组患者的中位OS显著长于低表达组（13.9个月vs. 3.5个月，p = 0.021)（图2）。
在多因素分析表明，较高的血清miR-10b-3p水平是OS的独立预测因子(风险比0.276,p = 0.003）。此外研究检测了39例患者(高表达组24例，低表达组15例)使用索拉非尼治疗后的血清miR-10b-3p水平，结果发现只有血清miR-10b-3p水平基线值较低但治疗后出现miR-10b-3p水平升高的患者，才能获得更长的OS时间。
图2
miR-10b-3p可通过抑制CCNE1进而促进索拉非尼对肝癌细胞的凋亡诱导作用
研究通过转染miR-10b-3p模拟物和抑制物来评估了miR-10b-3p过表达和缺失对索拉非尼所致肝癌细胞凋亡的影响。结果表明在肝癌细胞系中过表达miR-10b-3p可显著增强索拉非尼诱导的细胞凋亡，而miR-10b-3p缺失则抑制了索拉非尼诱导的凋亡作用，Western-Blot试验也证实过表达miR-10b-3p的肝癌细胞在使用索拉非尼处理后， 凋亡相关蛋白譬如PARP-1和caspase 3的裂解增加，而miR-10b-3p的缺失则抑制了这一现象。动物实验则表明，试验小鼠即使接种的是对于索拉非尼敏感的肝癌细胞株，若该细胞进行了miR-10b-3p缺失处理，该小鼠对于的索拉非尼的药物敏感性显著下降（图3）。
图3
此外研究者进一步探索了miR-10b-3p调控索拉非尼药效的潜在机制。研究使用基因芯片检测发现Huh-7细胞过表达miR-10b-3p，以及/或者使用索拉非尼处理后有18个基因表达水平出现明显下调。其中之一就是被证实为索拉非尼耐药关键调控因子的细胞周期蛋白E1 (CCNE1)。随后研究者使用双荧光素酶报告系统确认了内源性miR-10b-3p可靶向抑制CCNE1的表达。RT-qPCR和Western-blot试验表明过表达miR-10b-3p可显著降低CCNE1 mRNA、CCNE1 蛋白以及Rb蛋白的表达，而miR-10b-3p缺失可略微上调CCNE1 蛋白以及Rb蛋白水平，以上结果表明miR-10b-3p可作用于CCNE1这一关键耐药调控因子进而影响索拉非尼疗效（图4）。
图4
展望
晚期HCC的系统性治疗一直面临捉襟见肘的窘境，虽然免疫治疗和抗血管治疗作为后起之秀在晚期HCC治疗中大放异彩，但以索拉非尼为代表的小分子靶向药物依然贯穿于晚期HCC一线到多线治疗中。但遗憾的是在SHARP研究中， 索拉非尼单药用作晚期HCC一线治疗的疾病控制率约为43%[3]，意味着一半以上的患者接受索拉非尼治疗可能无效，在崇尚个体化治疗和精准医疗的今天，提前识别出索拉非尼治疗的潜在获益群体对于提高个体疗效，减少不必要的药物毒性具有重要意义。
miRNA除了调节细胞诸多功能，已经被证实可以作为细胞间通信分子传导信号，包括游离miRNA,外泌体包裹等形式发挥作用。尤其是血液中的循环miRNA ,对于许多疾病的诊断，预后判断具有良好的应用价值和潜在的治疗意义，譬如由上海复旦大学附属中山医院樊嘉院士领衔的团队从肝癌患者血清中筛选出包含7个miRNA在内的早期肝癌诊断组合，其诊断灵敏度和特异性均达80%以上，而且对于AFP阴性的肝癌患者依然能达到84%的灵敏度和88%的特异性，彰显了循环miRNA用于疾病诊断的巨大潜力[7]。
那么miRNA是否可以作为索拉非尼疗效预测的有效生物标志物呢？此前就有研究发现miR-122 and miR-34a表达水平和HCC患者接受分子靶向药物治疗的疗效相关[6]。在近日发表于英国癌症杂志的这一研究中，研究者发现较高的血清miR-10b-3p水平和较好的OS时间具有显著相关性，尤其是治疗前血清miR-10b-3p基线值较低而接受索拉非尼治疗后血清miR-10b-3p水平升高的患者更是主要的获益群体。此外研究者探索了miR-10b-3p调控索拉非尼疗效的潜在机制，发现miR-10b-3p可直接抑制索拉非尼耐药关键因子CCNE1的表达，进而提高索拉非尼对肝癌细胞的凋亡诱导作用。miR-10b-3p的抑癌作用早有报道，此前有研究发现miR-10b-3p可通过靶向作用于BUB1、PLK1和CCNA2进而抑制乳腺癌细胞增殖，降低动物模型体内肿瘤生长[8]。
当然该研究也存在样本量相对较小，缺乏组织学病理学检测等局限性，miR-10b-3p作为一种新型的生物标志物也需要前瞻性的临床试验进一步验证。但这一研究显示了miR-10b-3p的用于索拉非尼疗效预测的巨大潜力，更重要的是该研究揭示了miR-10b-3p影响索拉非尼疗效的可能靶点和机制，为克服索拉非尼耐药，提高药物疗效提供了重要的理论和试验基础。
1、Yu-Yun Shao, Pai-Sheng Chen, Liang-In Lin , Bin-Shyun Lee1,Andrew Ling, Ann-Lii Cheng, Chiun Hsu, andDa-Liang Ou, Low miR-10b-3p associated with sorafenib resistance in hepatocellular carcinoma;[J]Br J Cancer, 2022 Mar 2. doi: 10.1038/s41416-022-01759-w. Online ahead of print.
2、Llovet J M, et al. Sorafenib in Advanced Hepatocellular Carcinoma.;[J] N Emgl J Med. 2008; 359: 378-390.
3、Matthias Pinter, et al, The Current Landscape of Immune Checkpoint Blockade in Hepatocellular Carcinoma：A Review; [J]JAMA Oncology, Published online October 22, 2020.
4、Zhang PF, Wei CY, Huang XY, Peng R, Yang X, Lu JC, et al. Circular RNA circTRIM33-12 acts as the sponge of MicroRNA-191 to suppress hepatocellular carcinoma progression.;[J]Mol Cancer. 2019;18:105.
5、Komoll RM, Hu Q, Olarewaju O, von Dohlen L, Yuan Q, Xie Y, et al. MicroRNA-342-3p is a potent tumour suppressor in hepatocellular carcinoma.; [J]Hepatol. 2021;74:122–34.
6、 Fornari F, Pollutri D, Patrizi C, La Bella T, Marinelli S, Casadei Gardini A,et al. In hepatocellular carcinoma miR-221 modulates sorafenib resistance through inhibition of caspase-3-mediated apoptosis.;[J]Clin Cancer Res.2017;23:3953–65.
7、Kyoko Oura, Asahiro Morishita, Tsutomu Masaki,Molecular and Functional Roles of MicroRNAs in the Progression of Hepatocellular Carcinoma-A Review.;[J]Int J Mol Sci.2020 Nov 7;21(21):8362.
8、 Biagioni F, Bossel Ben-Moshe N, Fontemaggi G, Canu V, Mori F, Antoniani B, et al.miR-10b*, a master inhibitor of the cell cycle, is down-regulated in human breast tumours.;[J]EMBO Mol Med. 2012;4:1214–29.
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