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肺癌前沿：肺癌细胞遵从迥异的进化原则导致靶向耐药

2016年02月16日

专栏：肺癌前沿

编者：蔡微菁

一个好的研究犹如在讲一个精彩的故事，环环紧扣，方能引人入胜。最近刚被这样一个精彩的故事吸引了，于是分享给大家。抛砖引玉，希望能引发更深刻的思考和更精进的研究。故事的开头很普通，是从一株几乎任何一个研究肺癌的实验室都会有的肺癌细胞株PC9，在吉非替尼的刺激下形成了两种不同的耐药株开始的。

研究者在对PC9细胞株进行耐药诱导时，发现了两种EGFRT790M耐药突变形成时间完全不同的细胞株，PC9-GR2和PC9-GR3。两者对吉非替尼产生的耐药时间分别是6周和24周。虽然这两株细胞都可以被三代的EGFR-TKI——WZ4002所抑制，但敏感性却又有差异，PC9-GR2对WZ4002更为敏感。而PC9-GR3敏感性低的原因则是由于BIM蛋白的表达水平下调所致。同样的现象在体内实验中也被观察到了。

为什么同是获得性T790M突变耐药株，对三代抑制剂的敏感性不同呢？为什么同一株EGFR敏感突变的细胞用同一种药物诱导会产生两株敏感性不同、下游信号通路不同的耐药株呢？这两株耐药株在基因组学、蛋白组学、表观遗传学方面真的具有显著差异吗？那又是什么导致了这种差异的发生呢？研究者在一个看似浅显的现象后面，抛给我们一连串深奥的问题，而在我们急不可耐地想要知道真相之时，用缜密的逻辑将整个故事的推理娓娓道来。

首先，研究者将PC9细胞株培养了1200孔，每孔含5000个细胞。同时接受吉非替尼的诱导，观察耐药克隆的出现。2周后，他们发现5-10%的PC9细胞群出现了快速增殖，形成了耐药克隆。而其余的PC9细胞群仍仅存一小部分药物耐受的细胞存活。经q-PCR检测，确定早期耐药的克隆都含有T790M突变。且所有的克隆都对WZ4002敏感，而对吉非替尼不敏感。此外，还证实了WZ4002可以抑制这种T790M的早期出现，而针对其他吉非替尼耐受克隆有效的IGF-1R抑制剂——AEW541则对这种早期T790M的出现没有影响。由此，研究者推测早期耐药的EGFRT790M克隆的出现与药物耐受细胞无关。

那么，这些早期即产生T790M的细胞克隆是从何而来的呢？那些药物耐受的细胞克隆又是何时以及如何产生T790M的呢？研究者大胆推测肿瘤细胞克隆在药物选择的压力下产生的不同的进化方式是最根本的原因。于是，研究者先是假定这些早期耐药的含T790M突变的细胞是由存在于parental PC9细胞株中极少量的含pre-existing T790M的克隆进化而来的。研究者采用了一种比NGS、ddPCR更敏感的方法——DNA barcode library (ClonTracer)来证实其假设。利用慢病毒将极其复杂的DNAbarcode转染到培养的PC9细胞中，确保细胞克隆群中的每一个细胞都覆盖到，以此追踪肿瘤细胞克隆的进化。证实早期耐药的含T790M突变的克隆是起源于pre-existing EGFRT790M突变的细胞，并在吉非替尼的治疗选择之下快速增殖。

随后，研究者进一步证实了迟发T790M突变克隆的进化方式。他们用吉非替尼诱导了12-16周，培养出了16株不含T790M早期突变但对吉非替尼耐受的PC9细胞群，被称为“中间耐药”。“中间耐药”细胞对吉非替尼和WZ4002仍具有部分敏感性，且不存在T790M突变。这些细胞群继续被吉非替尼诱导直至完全耐药。16株中的5株出现了获得性T790M突变，对WZ4002的敏感性高于吉非替尼。在对这些迟发T790M突变克隆及PC9-GR3细胞株的克隆进化进行动态监测后发现，PC9-GR3细胞株的T790M突变最早出现于22周，发生于6%的细胞中，并在1个月之内成为优势克隆。另3株T790M迟发克隆分别在第34周、第43周及第47周最早检出T790M突变，并在随后的1个月之内成为优势克隆。这一结果证实了EGFRT790M耐药突变的确会在持续的药物诱导之下在T790M阴性的克隆中以de novo的方式出现。且研究者通过以单个PC9细胞建立无pre-existing T790M突变的亚克隆的方法进一步证实了这一进化方式，并建立了数学模型。经计算可得出，1.5%的药物耐受细胞会在相同的时间产生T790M突变。而且，这种进化方式也会在其他EGFR突变的肺癌细胞株中产生。

最后，这两种不同克隆进化方式产生的T790M突变细胞的生物学特征又是否一致呢？研究者对产生药物耐受的PC9细胞和亲代PC9细胞、PC9-GR2、PC9-GR3的转录谱进行比较，PCA分析也同样证实了迟发耐药的EGFRT790M突变起源自药物耐受细胞，且对药物耐受的生物学特征会在EGFRT790M突变获得之后仍持续存在。此外，研究者还通过对7株来自临床患者的肺癌细胞株的体外和体内实验，进一步证实了由药物耐受细胞进化而成的EGFRT790M细胞与pre-existing的EGFRT790M细胞相比，已减少了对EGFR通路的依赖性。换而言之，这类迟发的EGFRT790M突变细胞对WZ4002的敏感性是降低的，其生物学特征和耐药的机制更类似于药物耐受的T790M阴性细胞。究其原因，研究者认为是和BIM的表达水平相关。于是研究者筛选出了一个BCL-xL和BCL-2抑制剂ABT-263，可以联合三代EGFR-TKIs增加这类迟发T790M突变细胞对三代EGFR-TKIs的敏感性。相关的临床试验也已开展。AZD9291联合navitoclax治疗对一线EGFR-TKIs获得性耐药的EGFR突变NSCLC患者(NCT02520778)。

至此，一个由普通的PC9肺癌细胞株引发的，但不止于细胞株的研究故事结束了。如果它所采用的研究方法都真实可靠有效，那么这个研究故事所得出的结论也当然是令人信服的。它让我们更深刻地感受到了肿瘤进化的复杂性。一株单纯的肺癌细胞株，在单纯的体外培养下，也能发生两条不同的耐药进化途径以应对药物选择。那么，人体内的肿瘤在极其复杂的肿瘤微环境之中，又将会产生多少种不同的进化途径呢？有学者将恶性肿瘤的进化类比成物种的进化，每个肿瘤细胞克隆就类似于物种中的个体，都遵循达尔文的生物进化论，在自然的选择下优胜劣汰。但也有研究发现，肿瘤的进化受到非达尔文进化的力量在推动，这种非达尔文进化力赋予肿瘤克隆更多的突变、更复杂的多样性。无论是何种进化理论，多样性都是物种得以繁衍进化的基础，多样性也可能是肿瘤得以增殖转移的基础，这种肿瘤的多样性可以是在选择压力下不断进化累积所致，也可能是在进化伊始便被自然赋予。肿瘤的进化远比我们能想象得更为复杂。今天我们所窥见的都不过只是冰山一角，但无数这样的研究累加终有一天会揭开肿瘤神秘的面纱。真相揭开之时，便是肿瘤攻克之日。这是我们做肿瘤研究的真正意义所在，与所有的研究者们共勉。