肝细胞癌（HCC）是全球第六大常见恶性肿瘤，每年导致超过80万人死亡，5年生存率不足15%。尽管手术、消融和免疫检查点抑制剂（ICIs）等治疗手段不断进步，但术后复发率高及免疫治疗原发耐药仍是临床面临的重大挑战。肿瘤免疫微环境（TIME）中M2型肿瘤相关巨噬细胞（TAMs）浸润与免疫逃逸密切相关，而代谢重编程作为肿瘤核心特征之一，在调控免疫细胞功能中发挥关键作用。本研究旨在阐明去泛素化酶USP2通过调控脂质代谢介导HCC细胞与M2巨噬细胞交互的分子机制，并评估其作为治疗靶点的临床转化价值。
研究背景
HCC的进展伴随着显著的代谢重编程，其中脂肪酸从头合成增强是维持肿瘤快速增殖的重要特征。去泛素化酶（DUBs）通过调控蛋白质稳定性参与肿瘤发生发展，但其在HCC代谢－免疫交互中的作用尚未充分阐明。泛素特异性蛋白酶2（USP2）作为DUB家族成员，已被报道在多种肿瘤中稳定PD-L1等关键蛋白，但其在HCC脂质代谢及巨噬细胞极化中的作用仍属未知。过氧化物酶体增殖物激活受体γ（PPARγ）是脂质代谢的核心转录因子，其蛋白稳定性受泛素化调控。研究假设USP2通过去泛素化稳定PPARγ，促进脂肪酸合成，进而通过分泌脂肪酸诱导M2巨噬细胞极化，形成促肿瘤正反馈环路。
研究方法
患者来源类器官（PDO）与细胞模型：收集6例HCC手术标本构建PDO模型，采用22种DUB抑制剂（10 μM）筛选关键靶点。使用7404、Hep3B、HepG2、PLC/PRF/5、LM3等7种HCC细胞系，通过慢病毒shRNA构建USP2稳定敲低细胞系，转染Flag-USP2质粒构建过表达模型。
动物模型：14日龄C57BL/6雄性小鼠腹腔注射二乙基亚硝胺（DEN, 25 mg/kg）诱导原发性HCC模型，16周龄起给予USP2抑制剂ML364（5 mg/kg, 每2天一次）或联合抗PD-1抗体（10 mg/kg, 每周2次）治疗12周。皮下移植瘤模型使用Hepa1-6细胞（1×106/只），观察21天。采用脂质体氯膦酸盐清除巨噬细胞验证USP2功能依赖性。
代谢组学与分子机制：对PDO进行LC-MS代谢组学分析，检测游离脂肪酸（FFA）和甘油三酯（TG）水平。免疫共沉淀－质谱（IP-MS）鉴定USP2互作蛋白，免疫荧光观察USP2-PPARγ共定位。CUT&RUN-qPCR验证PPARγ对ACSS2、ACLY、ACACA启动子的结合。使用环己酰亚胺（CHX, 10 μg/mL）追踪PPARγ半衰期，MG132（10 μM）阻断蛋白酶体降解。检测K48/K63连接泛素链明确去泛素化类型。
免疫表型分析：THP-1细胞经PMA（100 nM, 48小时）诱导为巨噬细胞，与HCC细胞Transwell共培养。流式细胞术检测CD206+ CD11b+ F4/80+ M2巨噬细胞比例及GZMB+ IFN-γ+ CD8+ T细胞浸润。多重免疫组化分析M2标志物CD163、ARG1、IL-10表达。
生物信息学分析：整合11个HCC scRNA-seq数据集（GSE125449, GSE149614等），基于USP2表达水平分为高/低组，t-SNE可视化免疫细胞浸润。从TCGA获取365例HCC患者数据，计算风险比（HR）及95%置信区间（95%CI）。Kaplan-Meier法绘制生存曲线，log-rank检验比较差异。
研究结果
USP2抑制剂ML364显著抑制HCC PDOs活性
对6例HCC PDOs筛选22种DUB抑制剂，发现ML364（USP2选择性抑制剂）呈剂量依赖性抑制PDO活力（IC50 2-5 μM），10 μM处理48小时使细胞活力降低超过70%（P < 0.001）。在7404、Hep3B等细胞系中，ML364（5 μM）显著抑制克隆形成（抑制率>60%, P < 0.01）和侵袭能力（P < 0.001）。DEN诱导的原发性HCC模型中，ML364治疗组肝肿瘤数量较对照组减少58%（P < 0.01），血浆AFP水平下降62%（P < 0.001），证实USP2是HCC治疗的关键靶点。
USP2通过PPARγ调控脂肪酸从头合成
代谢组学分析显示，ML364处理使PDO中不饱和脂肪酸合成通路显著抑制，其中油酸水平下降最显著（FC = 0.31, P < 0.001）。LM3细胞中，ML364（5 μM）使FFA和TG水平分别降低52%和48%（P < 0.01）。RT-qPCR证实ACSS2、ACLY、ACACA mRNA表达下调>60%（P < 0.001）。IP-MS鉴定PPARγ为USP2直接互作蛋白，分子对接显示USP2的S576/R270位点与PPARγ的D251/E351位点结合（结合能-12.3 kcal/mol）。Co-IP验证内源性USP2-PPARγ相互作用，免疫荧光显示二者部分共定位于胞质。
USP2通过K48连接去泛素化稳定PPARγ
USP2敲低使PPARγ蛋白水平下降70%（P < 0.001），而mRNA无变化。MG132处理可逆转此效应，表明其通过蛋白酶体途径降解。CHX追踪实验显示USP2敲低使PPARγ半衰期从8.2小时缩短至2.1小时（P < 0.001）。泛素化实验证实USP2野生型（WT）而非催化失活突变体（C276A）显著降低PPARγ多泛素化水平。使用K48/K63突变泛素显示，USP2特异性去除K48连接泛素链。通过构建PPARγ截断突变体，鉴定DBD结构域为USP2作用区段。进一步点突变筛选确定K142位点是USP2去泛素化的关键赖氨酸残基，K142R突变使PPARγ泛素化水平降低85%（P < 0.001）。
图3 USP2通过靶向K48连接的泛素化在PPARγ的K142位点稳定PPARγ蛋白
PPARγ转录激活脂肪酸合成基因
CUT&RUN-qPCR显示PPARγ直接结合ACLY启动子区（-427/-408）、ACACA启动子区（-801/-782）及ACSS2启动子区（-644/-625）。USP2敲低使PPARγ在这些区域的富集度下降>75%（P < 0.001）。双荧光素酶报告基因实验证实，PPARγ过表达使ACLY、ACACA、ACSS2启动子活性分别提升3.2倍、2.8倍和2.5倍（P < 0.001），而K142突变体丧失此功能。在USP2敲低细胞中过表达PPARγ-WT可恢复脂肪酸合成，而转录失活突变体PPARγ-ΔDBD无此作用，证实USP2-PPARγ轴以转录依赖方式调控代谢。
油酸通过增强脂肪酸氧化诱导M2巨噬细胞极化
将LM3细胞来源的油酸（100 μM）添加至THP-1巨噬细胞，使CD206+ M2比例从12%升至45%（P < 0.001），IL-10和TGF-β分泌增加2.5倍和1.8倍（P < 0.01）。Seahorse检测显示油酸使巨噬细胞氧消耗率（OCR）提升1.7倍，脂肪酸氧化（FAO）增加2.3倍，ATP产生增加1.9倍（P < 0.01）。FAO抑制剂perhexiline（5 μM）可阻断油酸诱导的M2极化，使CD206+比例恢复至15%（P < 0.001）。Transwell共培养实验显示，ML364处理的LM3细胞使共培养巨噬细胞CD206表达降低65%（P < 0.001），而补充油酸可逆转此效应，证实油酸是连接USP2与巨噬细胞极化的关键代谢物。
M2巨噬细胞分泌IL-10形成STAT3-USP2正反馈环路
M2巨噬细胞条件培养基使HCC细胞USP2 mRNA和蛋白表达分别上调2.8倍和2.4倍（P < 0.01），而M0/M1亚型无此作用。ELISA筛选显示IL-10（50 ng/mL）诱导USP2表达最强（P < 0.001）。IL-10激活STAT3磷酸化，sh-STAT3或抑制剂static（10 μM）可阻断M2条件培养基诱导的USP2上调。CUT&RUN-qPCR鉴定USP2启动子区-494/-484存在STAT3结合位点，突变该位点使IL-10诱导的USP2启动子活性降低78%（P < 0.001）。这形成“USP2-PPARγ-油酸-M2-IL-10-STAT3-USP2”正反馈环路，持续驱动肿瘤进展。
USP2高表达与M2浸润及不良预后相关
分析11个HCC单细胞数据集（n = 378），USP2高表达组M2标志物（CD163、ARG1、IL-10）阳性巨噬细胞比例较USP2低表达组增加2.1倍（P < 0.001），而CD8+ T细胞浸润减少58%（P < 0.01）。多色免疫组化显示USP2高表达肿瘤中CD206+ TAMs密度增加3.5倍（P < 0.001）。94例HCC切除队列中，USP2高表达（IHC评分>中位数）患者5年总生存率降低（HR = 2.31, 95%CI=1.18~4.52, P = 0.014），多因素Cox回归确认其为独立预后因素。
靶向USP2联合PD-1阻断增强抗肿瘤免疫
在DEN诱导HCC模型中，ML364联合抗PD-1抗体使肿瘤负荷较单药组进一步降低45%（P < 0.001），肿瘤内GZMB+ IFN-γ+ CD8+ T细胞浸润增加3.8倍（P < 0.001）。皮下移植瘤模型中，联合治疗组肿瘤重量较对照组减少82%（P < 0.001）。使用clodronate脂质体清除巨噬细胞后，USP2过表达的促肿瘤作用消失（P > 0.05），CD8+ T细胞功能恢复，证实USP2通过调控巨噬细胞影响免疫应答。
本研究系统阐明了USP2-PPARγ-油酸代谢轴在HCC进展与免疫抑制中的核心作用。USP2通过K48连接去泛素化稳定PPARγ K142位点，促进脂肪酸合成基因转录，导致油酸分泌增加。油酸作为代谢信号分子，增强巨噬细胞FAO推动M2极化，分泌的IL-10激活STAT3进一步上调USP2，形成正反馈环路。这一环路不仅驱动肿瘤代谢重编程，还抑制CD8+ T细胞功能，造成免疫逃逸。
本研究的临床意义在于：首先，USP2是HCC预后预测的生物标志物，高表达者需强化辅助治疗；其次，ML364联合ICIs显示协同效应，为克服免疫耐药提供新策略；最后，靶向代谢-免疫交互的联合方案代表精准治疗新方向。未来需开展ML364的临床转化研究，并探索USP2在复发监测中的应用价值。
Cao J, Chen K, Hu K, et al. USP2-mediated PPARγ stabilization promotes hepatocellular carcinoma progression and M2 macrophage polarization via oleic acid. J Immunother Cancer. 2025;13(11):e012721. Published 2025 Nov 4. doi:10.1136/jitc-2025-012721
审批号：CN-175729
审批时间：2025-12-23
有效期至：2026-12-23
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排版编辑：肿瘤资讯-李鑫
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