甲状腺乳头状癌（PTC）是最常见的内分泌恶性肿瘤。BRAF V600E突变导致MAP激酶通路的致癌性激活，并在PTC的发生及侵袭性中起关键作用。在BRAF V600E突变型与非突变型 PTC之间已观察到显著的形态学差异。BRAF V600E突变与不良的临床病理特征相关，包括淋巴结转移、复发、肿瘤大小、甲状腺外侵犯及不良预后，特别是当突变等位基因丰度较高时。然而，突变肿瘤细胞的比例与 PTC 形态学特征之间的关系尚不清楚。本研究旨在探讨突变肿瘤细胞比例与PTC形态学特征之间的潜在联系，并评估将等位基因频率归一化为用于 DNA提取的组织中肿瘤细胞百分比后的影响。
研究背景
甲状腺乳头状癌（PTC）作为临床最常见的内分泌系统恶性肿瘤，占据了所有甲状腺肿瘤病例的80%至90%。作为一种具备滤泡细胞分化特征的上皮性恶性肿瘤，PTC在临床上常表现为不规则的实性甲状腺肿块。尽管从总体预后来看，PTC通常被归类为低风险肿瘤，但流行病学数据显示其发病率在各国均呈上升趋势，且长期复发率约为20%至30%，部分病例甚至具有致命潜力。
在PTC的分子发病机制中，BRAF V600E突变占据核心地位，存在于约45%的病例中。该突变通过致癌性激活丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）通路，驱动了肿瘤的发生与进展。临床研究已证实，BRAF V600E突变与诸多不良临床病理特征密切相关，包括淋巴结转移、甲状腺外侵犯、晚期TNM分期以及较高的复发风险。此外，BRAF V600E突变不仅影响肿瘤的生物学行为，还深刻塑造了其组织学形态。相比于常与RAS突变相关的滤泡型PTC，经典型和高细胞型PTC与BRAF突变的关联更为紧密。
既往由Prasad团队等开展的研究表明，BRAF V600E突变型与野生型PTC在形态学上存在显著差异。诸如浸润性生长、高细胞变体、间质反应及具有嗜酸性胞浆的“肥胖粉红细胞”等特征，在很大程度上可预测该突变的存在。然而，目前的认知多基于将BRAF突变视为“有或无”的二元变量，忽略了肿瘤内部的克隆性异质性。事实上，突变等位基因丰度（等位基因分数）的高低往往对应不同的临床结局。但由于DNA提取过程中不可避免地混入了间质、淋巴细胞等非肿瘤成分，直接测得的突变频率往往不能真实反映肿瘤细胞内部的遗传状态。因此，探讨将等位基因频率归一化为肿瘤细胞百分比后的真实突变负荷，对于理解PTC的形态学演变及克隆进化具有重要意义。
研究对象与方法
本研究回顾性分析了跨度为12年的85例甲状腺乳头状癌病例。研究的核心目标是评估归一化后的BRAF V600E突变比例与特定形态学特征之间的关联。这些形态学特征包括但不限于浸润性肿瘤边缘、肥胖粉红细胞、间质增生、肿瘤大小、手术切缘状态、淋巴结及远处转移、多灶性及核异型性等。
在实验设计上，研究采用焦磷酸测序法进行DNA突变分析。为了校正非肿瘤细胞对测序结果的稀释效应，研究人员从用于DNA提取的组织切片中均匀选取20个显微镜视野，排除血管、淋巴和间质细胞，估算肿瘤细胞（MNC）在组织中的实际百分比。随后，应用特定公式对测得的等位基因频率进行归一化处理。根据归一化后的突变肿瘤细胞百分比，将肿瘤分为三个克隆性组别：亚克隆型（突变肿瘤细胞 < 30%）、异质型（突变肿瘤细胞 30%–80%）以及克隆型（突变肿瘤细胞 > 80%）。数据分析涵盖了四分位间距（IQR）计算及多因素Logistic回归分析，以确保结果的统计学严谨性。
研究结果分析
突变分布与克隆性特征
在纳入研究的85例患者中，57例（67.1%）检测到BRAF突变（≥10%）。然而，经过归一化处理后，病例展现出了复杂的克隆结构分布：36.5%为亚克隆性，41.2%为异质性，仅有22.3%表现为高度克隆性（MNC > 80%）。这一结果揭示了即便是BRAF阳性的肿瘤，其内部细胞群体的遗传背景也存在显著的异质性。在方法学验证方面，两名独立观察者对恶性细胞百分比的目测估算表现出中等的一致性（ICC = 0.657），但当数据转化为归一化的突变肿瘤细胞百分比时，观察者间的一致性显著提升（ICC = 0.960），证明了该方法的可靠性。
形态学特征与突变负荷的关联
本研究最重要的发现在于形态学特征与归一化突变负荷之间存在的强相关性。通过详细的统计分析，研究确认了浸润性边缘、肥胖粉红细胞及黏液样结缔组织增生与高突变负荷的特定联系。
多因素回归分析显示，浸润性肿瘤边缘是预测高突变负荷的独立因子（OR = 8.53）。这一形态学特征不仅仅是物理上的边界描述，更是肿瘤生物学行为的反映。在克隆性组（MNC > 80%）中，19例中有18例（94.7%）表现出浸润性边缘，统计学差异极显著（p < 0.001）。这意味着当BRAF突变在肿瘤细胞中占据主导地位时，肿瘤几乎必然表现出向周围组织的浸润性生长模式，而非膨胀性或包膜内生长。
关于细胞形态的改变，肥胖粉红细胞与异型性成为了另一个关键指标。肥胖粉红细胞（具有宽大嗜酸性胞浆）在47.1%的病例中出现，且与较高的MNC百分比显著相关（p = 0.007）。研究还描述了一种“粉红异型性”（pink atypia），即在浸润灶内粉红细胞表现出的形状和大小不规则，这种特征高度提示BRAF突变的克隆性扩增。四分位间距分析进一步显示，具有这些特征的病例，其中位数突变细胞比例接近60%，表明嗜酸性胞浆改变可能与突变驱动的代谢重编程密切相关。
此外，间质反应的性质也具有重要的提示意义。研究发现，黏液样结缔组织增生与单纯的纤维化不同，伴有黏液样基质的结缔组织增生与高MNC百分比及克隆性呈强相关（p = 0.002）。在IQR分析中，表现出这种特异性间质反应的病例，其中位数突变比例约为70%。这表明，BRAF驱动的克隆性肿瘤细胞可能通过分泌特定的基质金属蛋白酶或其他因子，诱导了微环境中成纤维细胞的增殖及基质的黏液样变性，而非简单的胶原纤维化
肿瘤大小与临床病理预后
肿瘤的大小与克隆性状态呈现出显著的统计学关联（p = 0.006）。数据显示，大多数直径小于或等于2厘米的肿瘤属于亚克隆或异质性组，而克隆性肿瘤中超过半数直径大于2厘米。这一发现支持了BRAF突变在肿瘤生长过程中逐步累积并占据主导地位的假设。
在临床预后指标方面，高突变细胞比例（克隆性）直接指向更差的病理结果。克隆性与远处转移（p = 0.037）以及手术切缘受累（p = 0.022）存在显著相关性。虽然淋巴结转移在常规二元分析中未达显著性差异，但在更精细的四分位间距分析中显示出统计学意义（p = 0.02），且手术切缘阳性的病例在IQR分析中显示其中位数突变比例超过50%。这些数据共同表明，随着突变细胞在肿瘤负荷中占比的增加，肿瘤的侵袭和转移能力也随之增强。
研究讨论
本研究的核心价值在于提出并验证了将BRAF等位基因频率归一化为实际肿瘤细胞百分比的必要性。传统的二分法（阳性/阴性）忽略了间质、血管及淋巴细胞对DNA样本的稀释作用，导致对肿瘤真实生物学状态的误判。通过归一化处理，我们揭示了PTC内部复杂的克隆结构：完全的克隆性并非普遍现象，相当一部分BRAF阳性肿瘤实际上处于亚克隆或异质性阶段。
基于研究结果，我们提出了一组由“浸润性边缘、肥胖粉红细胞、黏液样结缔组织增生”构成的形态学三联征。这组特征不仅仅是病理诊断的描述性术语，更是高BRAF突变负荷的替代标志物。浸润性边缘的存在与极高的突变细胞比例相关，解释了为何临床上浸润性强的肿瘤往往预后较差。肥胖粉红细胞的嗜酸性形态可能与Warburg效应相关的代谢重编程有关，文献指出这种胞浆改变涉及线粒体的异常聚集及氧化磷酸化功能的受损，而本研究发现这些细胞在克隆性肿瘤中富集，暗示了BRAF突变驱动下的代谢改变是肿瘤细胞获得生存优势的机制之一。最后，黏液样结缔组织增生被认为是肿瘤细胞重塑微环境的结果，其与高突变负荷的强相关性表明这是BRAF驱动的肿瘤-间质相互作用的特定产物。
此外，肿瘤大小与克隆性的关系为PTC的演进提供了动态模型。较小的肿瘤多为亚克隆或异质性，暗示在肿瘤发生早期，BRAF突变可能尚未在细胞群体中占据完全主导；随着肿瘤体积的增大，携带突变的亚克隆逐渐扩增并占据优势（即克隆化），进而表现出更强的侵袭性。值得注意的是，部分病例计算出的突变细胞百分比超过100%，这归因于基因组的不稳定性，如突变等位基因的特异性扩增或杂合性缺失，进一步证实了PTC遗传背景的复杂性。
研究结论
综上所述，本研究通过对BRAF V600E等位基因频率的归一化处理，深入阐明了突变肿瘤细胞百分比与甲状腺乳头状癌形态学及生物学行为之间的内在联系。研究确立了浸润性肿瘤边缘、伴有粉红异型性的肥胖粉红细胞以及黏液样结缔组织增生作为反映高BRAF突变负荷及克隆性的关键形态学标志物。这三者构成的动态组织病理学特征，能够辅助病理学家在显微镜下初步评估肿瘤的分子克隆状态。同时，较高的突变肿瘤细胞百分比与手术切缘受累、淋巴结转移风险增加及远处转移密切相关，提示量化的克隆性分析具有重要的预后价值。将归一化公式应用于常规分子检测，并结合显微镜下的形态学评估，能够更准确地描绘肿瘤的克隆结构与异质性，为PTC的精准风险分层和个性化治疗提供了坚实的理论基础。
Maria Soledad Martínez-Martin, María Eugenia Galán-García, Eduardo José Araujo Ruano, et al. Papillary thyroid carcinoma: morphological features and association with normalized BRAFV600E allelic frequency; clonality and morphology investigating mutations through microscopy. Thyroid Res. 2025 Dec 2;18(1):57. doi: 10.1186/s13044-025-00275-2.
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