侵袭性甲状腺癌——包括未分化甲状腺癌（ATC）和低分化甲状腺癌（PDTC）——虽然少见，却是致死率极高的恶性实体瘤。目前对其免疫表型特征的描述尚不完整，且缺乏标准化的诊断算法。
近期，一项研究回顾性分析了2014年至2024年间进行的40例甲状腺切除病例（12例ATC和28例PDTC）。结果发现， 70%的病例存在BRAF V600E表达，其中ATC的患病率更高。标志物表达模式表明，BRAF或RAF激活随后导致的TTF-1或PAX-8缺失、TERT上调以及TP53改变是侵袭性甲状腺癌中的常见事件。TTF-1缺失与未分化转化之间的关联，以及坏死与BRAF V600E共存的现象，突显了其在侵袭性甲状腺癌亚分类中的诊断潜力。
侵袭性甲状腺癌的分子病理背景与研究目的
全球癌症观察站（Global Cancer Observatory）数据显示，甲状腺癌的发病率和肿瘤体积在过去20年间大幅增长，且确诊年龄呈下降趋势。尽管实施了公共卫生政策和更优的治疗手段，其死亡率仍保持平稳甚至缓慢上升。
根据第5版WHO肿瘤分类，甲状腺恶性肿瘤中最罕见的亚型是高级别滤泡细胞起源的非未分化甲状腺癌和 ATC，其累计频率占所有甲状腺恶性肿瘤的2%-10%。第一类包括新引入的分化型高级别甲状腺癌和PDTC。由于预后差、临床结果不佳及治疗选择有限，PDTC和ATC均属于侵袭性类型。大多数ATC和PDTC由于细胞膜上钠碘同转运体（NIS）的缺失，无法摄取 I131，从而表现出放射性碘难治性。相比之下，分化型甲状腺癌的5年生存率超过95%，而PDTC的5年生存率为78%，ATC的2年生存率仅为11.5%。此外，美国癌症联合委员会（AJCC）分期将ATC定义为 IV 期，而不论肿瘤大小或年龄；相比之下，PDTC根据肿瘤大小、淋巴结状态和转移情况，在55岁以下患者中被分类为I或II期。
对于PDTC的诊断，都灵标准（Turin criteria）是目前的实际标准，但其中不包含免疫组化或分子参考指标。已知肿瘤细胞在多步进展过程中积累突变事件：早期驱动突变被认为是BRAF和RAS激活（在PDTC中更常见）；晚期事件则是与高转移潜能相关的TERT突变及TP53改变。ATC被认为是滤泡细胞肿瘤进展的终点，同时获得了早期和晚期驱动突变，完全丧失了滤泡细胞的形态特征。在所有这些标志物中，第5版WHO肿瘤分类仅推荐对BRAF V600E进行免疫染色。
尽管文献中包含许多评分系统，但在侵袭性甲状腺癌方面缺乏统一标准。例如，关于Ki-67增殖指数的阈值差异很大。现有文献主要探讨PAX-8、TTF-1、P53、TERT、Ki-67、BRAF和KRAS等标志物。此外，特异性抗BRAF V600E突变蛋白抗体作为可靠诊断标志物的有效性仍待验证。本研究旨在通过免疫组化分析探索PDTC和ATC的免疫表型，包括将BRAF V600E作为单独的诊断标志物及其与抗 BRAF 总蛋白抗体的比较，并建立临床因素与免疫表型之间的联系。
研究对象筛选、免疫组化评分及分子检测方法
本研究对BRAF V600E突变DTC和RAIR-DTC组织样本进行RNA测序，以鉴定差异表达基因。发现Gadd45B在RAIR-DTC中显著下调。在甲状腺癌细胞系和异种移植模型中进行了包括过表达和敲低实验在内的功能研究。通过免疫共沉淀、荧光素酶报告基因实验和Western blot评估了包括MAP3K4和MYCBP在内的下游靶点。在PDX模型中评估了重组Gadd45B蛋白联合BRAF与TERT抑制剂的疗效。
研究结果
病例选择与研究组群构建
本研究回顾性分析了“C.I. Parhon”国家内分泌研究所档案中2014年至2024年间接受甲状腺全切除术的40例侵袭性甲状腺癌患者（28例PDTC，12例ATC）。选择标准为：完整的临床数据、可用的福尔马林固定石蜡包埋（FFPE） 组织块、组织病理学确认及原发性肿瘤。排除继发性肿瘤、细针穿刺样本及数据缺失病例。三位病理学家独立评估HE切片以确认诊断。PDTC应用都灵共识标准，ATC遵循WHO第5版分类标准。
免疫组化
将FFPE组织切成4μm切片，在BOND-MAX全自动染色系统上进行免疫组化。抗体包括BRAF V600E（VE1克隆）、总BRAF、K-RAS、TERT、PAX-8、TTF-1、P53和Ki-67。对于BRAF V600E，采用了延长的30分钟一抗孵育方案。
评分系统如下：BRAF、K-RAS、TERT和PAX-8根据染色范围评分（0至+3）；TTF-1（<15%低，15-50%中，>50%正常）；P53（>10%或完全缺失视为突变型）；Ki-67（<5%低，5-10%中，10-20%高，>20%极高）。
分子评估
从FFPE切片中提取DNA。对BRAF基因第15外显子（含V600E位点）和TERT启动子区（含C228T/C250T位点）进行PCR扩增，产物经纯化后进行双向Sanger测序。
统计分析
使用JASP软件进行分析。正态分布检验采用Shapiro-Wilk法。组间比较采用卡方检验或独立样本t检验。相关性分析采用Spearman’s Rho (ρ)。预测因子评估采用单变量和多变量逻辑回归。P < 0.05视为具有统计学显著性。
临床病理特征、标志物表达谱系及相关性分析结果
临床病理特征
在40例患者中，PDTC28例，ATC12例。5例（17.8%）PDTC与乳头状甲状腺癌（PTC）共存，ATC无伴发PTC。女性占比67.5%。ATC组的肿瘤坏死发生率（58.3%）显著高于PDTC组（17.8%）（p = 0.010）。血管侵犯总体占比87.5%，甲状腺外侵犯在ATC组（88.9%）略高于PDTC组（78.6%）。根据AJCC分期，所有ATC患者均为 IV 期。Guo等人提出的分期系统与AJCC的一致性为64.3%。
免疫组化分析
MAPK/ERK通路（BRAF, K-RAS）： BRAF V600E突变蛋白在12例（70%）中阳性，ATC组（50%）显著高于PDTC组（21%）（p = 0.025）。总BRAF蛋白在45%的患者中升高，PDTC组（50%）略高于ATC 组。K-RAS在60%的病例中异常表达。
核转录因子（TERT, PAX-8）： TERT在95%的病例中过度表达（ATC 100%，PDTC 92%）。PAX-8在75%的病例中表达下调，组间无显著差异。
分化标志物（TTF-1）： PDTC组71%表现为TTF-1正常，而ATC组仅25%正常，41%缺失。TTF-1的缺失与更高级别的组织学亚型显著相关（p = 0.003）。
增殖与肿瘤抑制（Ki-67, P53）： 总体47%的患者Ki-67指数高于正常，ATC组评分显著更高（p = 0.014）。P53在50%的病例中表现为突变型表达，组间差异未达显著性
分子评估
分子检测显示，全队列中42.1%携带 BRAF V600E 突变。PDTC 组（42.8%）的突变率显著高于ATC 组（30%）（p = 0.018）。关于TERT突变，PDTC组（32.1%）的改变显著高于ATC组（10%）（p = 0.036）。
相关性与回归分析
TTF-1与PAX-8表达呈强正相关（ρ = 0.711）。总 BRAF水平与K-RAS呈中度正相关，但与BRAF V600E呈弱负相关。
单变量逻辑回归显示，Ki-67 增殖指数、TTF-1 缺失和坏死均为高级别诊断（ATC）的独立预测因子。然而在多变量分析中，仅 TTF-1 缺失（p = 0.028）和坏死（p = 0.012）保持显著性。对于转移预测，淋巴结受累是唯一可靠的因子。特异性 BRAF V600E 免疫组化是分子突变的良好预测因子（OR = 6.00）。
一致性分析
BRAF V600E特异性抗体（VE1 克隆）对比Sanger 测序显示出50%的敏感性和86.4%的特异性，表明其可作为筛选工具。TERT免疫组化的特异性仅为3.6%，无法作为可靠的筛查方法。
研究点评与小结
本研究通过免疫表型分析建立了一个评估侵袭性甲状腺癌不同细胞通路的组合。研究发现ATC与 BRAF V600E突变蛋白的高表达显著相关，这与既往文献一致。有趣的是，我们观察到总BRAF蛋白染色量与特异性BRAF V600E染色水平呈负相关，这与主要关注PTC的文献结论相反。造成这一差异的原因可能包括技术伪影、抗体特异性差异（VE1 仅识别突变型，而总BRAF结合野生型和突变型）以及固定时间的影响。这提示总BRAF的诊断价值有限，应优先使用标准化的BRAF V600E特异性抗体。
BRAF V600E突变通过组蛋白去乙酰化酶上调导致 NIS启动子乙酰化，引起NIS低表达，从而导致放射性碘难治性及肿瘤去分化。尽管如此，目前指南尚未常规推荐术后分子检测。K-RAS的异常表达与总 BRAF相关，提示下游核效应的联系。我们仅测试了K-RAS亚型，因其可能界定独特的临床病理实体，且有望成为未来治疗的靶点。
TTF-1和PAX-8作为甲状腺身份的编码者，在侵袭性癌中倾向于丢失。两者间的强正相关性支持了它们相互诱导表达的观点。TTF-1对表观遗传事件更敏感，其缺失在预测侵袭性形式中具有重要价值。
我们观察到BRAF V600E突变与TERT (C228T) 显著相关，主要见于PDTC，表明两者协同促进发病。文献荟萃分析显示，这种共突变与最差的预后（如复发、死亡率、转移）相关。Ki-67在单变量分析中是侵袭性亚型的预测因子，但在多变量分析中被 TTF-1和坏死取代，这并不否定其作为侵袭性标志物的作用。对于检测方法，VE1抗体被证明是筛查 BRAF V600E的可靠工具，但TERT的免疫组化效果不佳。
本研究的局限性在于回顾性设计和较小的样本量，且缺乏生存数据限制了对预后相关性的全面评估。
综上所述，本队列中的侵袭性甲状腺癌表现出特定的免疫表型特征：频繁的BRAF V600E突变蛋白存在、总BRAF 或 K-RAS表达、TERT 过表达、PAX-8 保留伴随TTF-1缺失、突变型P53模式以及高Ki-67指数。分子谱系确认了PDTC中频繁的BRAF V600E 与TERT C228突变的关联，识别出一种可能的突变特征。
在多变量分析中，TTF-1缺失和肿瘤坏死是未分化转化的独立预测因子；淋巴结侵犯是转移存在的独立预测因子。BRAF/RAS、TERT和TP53之间的相关性表明分子失调是多通路纠缠的结果。纳入BRAF V600E、总BRAF、TERT、PAX-8、TTF-1、P53和 Ki-67的综合免疫组化组合有助于提高诊断准确性，并可能辅助侵袭性甲状腺癌的预后分层。
Mihail Ceausu, Mihai Alin Publik, Dana Terzea, et al. Immunophenotypic Panel for Comprehensive Characterization of Aggressive Thyroid Carcinomas. Cells 2025, 14(19), 1554.
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