半夏泻心汤（BXD）是一种具有抗结直肠癌（CRC）活性的传统中药。然而，其生物活性成分及其作用机制仍不清楚。2023年发表在Phytomedicine的研究发现并证明了传统药物在治疗 CRC 方面的巨大潜力，并支持它们在联合化疗、靶向治疗和免疫治疗中的更广泛临床应用。在网络药理学分析中药复方活性成分基础上，运用HPLC验证，并结合体内和体外实验对预测的机制进行细胞和动物两个层面的论证，本研究可谓是中医药领域“干湿结合”研究可借鉴的模式。【中医肿瘤资讯】小编将对该研究进行详细解读，以飨读者。
【研究背景】
结直肠癌（CRC）是一种常见的消化道恶性肿瘤，在中国的发病率仅次于肺癌和胃癌，居第三位。在中国，CRC 是导致癌症相关死亡的第五大原因，高于其他发展中国家。目前的 CRC 治疗方案包括手术、放疗和化疗。尽管出现了新的辅助治疗方法，如生物制剂和免疫疗法，但 CRC 治疗效果仍然有限。因此，急需新的、更有效的方法来预防和治疗 CRC。目前，大多数 CRC 的起源被认为是干细胞或类干细胞。这些癌症干细胞是由于遗传和表观遗传学改变而逐渐积累引起的。铁在许多生物过程中发挥着重要作用，其在 CRC 发病机制中的作用也引起越来越多的关注。多项研究全面证实了全身铁的水平与 CRC的发生和发展直接相关。铁会产生氧自由基，进而导致铁诱导的细胞凋亡或铁死亡。铁也是免疫功能的重要介质， 在肿瘤免疫微环境中发挥重要作用。由此可见，阐明铁在肿瘤微环境中的作用至关重要，因为它可能是抗癌药物的重要靶点。
中医药在治疗多种癌症方面疗效显著，与许多常用化疗药物相比，中医药治疗的不良反应较少。然而，中药成分复杂，一般具有多个靶点，这给确定其具体的作用机制带来了挑战。半夏泻心汤（BXD）在中国用于治疗消化系统疾病已有 1800 年的历史。它由七种天然药物组成，每种药物都含有多种天然化合物。BXD 中含有大量的甘草苷、芦丁、黄芩苷、小檗碱、6-姜酚和人参皂苷 Rh2，具有抗炎、免疫调节、抗癌和抗氧化作用。迄今为止，临床和体外研究都证实了 BXD 的强效抗癌活性。将 SW480 CRC 细胞移植到裸鼠体内后，BXD 可调节肿瘤裸鼠体内的氧化应激和炎症反应，通过凋亡和丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）/核因子κB（NF-κB）途径对肿瘤产生明显的抑制作用。此外，一项临床试验显示，改良后的BXD联合化疗可显著缓解III期CRC（寒热错杂型）患者的临床症状，减少化疗相关不良反应，改善患者生活质量，延长无病生存期（DFS）。然而 BXD 的活性成分及其潜在的分子机制在很大程度上仍未明确。目前，网络药理学已成为阐明天然药物作用机制的一种重要方法。因此，本研究 (i) 使用网络药理学来探索 BXD 对 CRC 影响的具体机制，并（ii）使用体外和体内 CRC 模型验证了研究结果。
【材料与方法】
使用高效液相色谱法测定 BXD 的活性成分和含量
网络药理学分析
细胞培养
细胞增殖实验
细胞迁移实验
铁水平检测
细胞内ROS生成测定
电镜分析细胞形态
动物实验（裸鼠皮下异种移植模型构建）
肿瘤体积测定
Western blot
【结果】
图1 通过HPLC鉴定BXD的主要化学成分
(A) 六种化合物和 BXD 煎剂的混合标准溶液色谱图。其中，峰1为甘草苷；峰2为芦丁；峰3为黄芩苷；峰4位人参皂苷 Rh2；峰5为小檗碱；峰6为6-姜酚。(B) 六种成分的具体化学结构。
图2 化合物-靶标网络图
红色圆点代表7种药物，绿色圆点代表158种化合物，蓝色圆点代表146个治疗靶点。将BXD中的药物、化合物和靶点通过化合物-靶点网络图进行连接。
图3 关键靶点预测
(A) CRC 中 BXD 靶点的 PPI 网络。(B) 根据从低到高的程度顺序对核心靶标进行排序。进行了 GO 分析，从细胞组分（CC）（C）、分子功能（MF）（D）和生物过程（BP）（E）类别中选出了 146 个靶点的共同生物学功能。颜色代表不同的 P 值。圆圈大小代表计数。
表1 KEGG富集分析结果展示
图4 BXD 成分对HCT116 细胞增殖和迁移的影响
(A) 用浓度为 0、100、200、400、800 和 1600 μg/ml 的 BXD 成分混合物处理 HCT116 细胞。使用 MTT实验测定细胞活力，并计算 IC50 值。HCT116 细胞用浓度为 150、304 和 600 μg/ml 的 BXD 主要成分处理。(B）使用 EdU 标记进行细胞增殖检测。DNA染成蓝色；增殖细胞染成绿色。(C）使用划痕愈合实验测定 HCT116 细胞的迁移能力。（D）采用 Transwell 迁移实验评估 HCT116 细胞的迁移能力。
图5 BXD 成分对体外 HCT116 细胞中铁和 ROS 水平的影响
用浓度分别为 150、304 和 600 μg/ml 的 BXD 主要成分处理 HCT116 细胞。 (A) 使用铁测定试剂盒检测总铁和亚铁水平。(B) 使用 ROS 检测试剂盒检测细胞内 ROS 含量。绿色荧光表示 ROS 水平较高。
图6 BXD成分诱导的 CRC 细胞铁自噬作用机制
用浓度为 150、304 和 600 μg/ml 的 BXD 成分处理 HCT116 细胞。 (A) 用 Western blot 检测 FTH1 (a)、GPX4 (b)、PI3K、p-PI3K (c)、LC3 (d)、NCOA4 (e)、AKT、p-AKT (f)、mTOR 和 p-mTOR (g) 的表达。β-微管蛋白作为对照。与对照组相比，*P < 0.05，**P < 0.01。(B) 细胞固定后的电子显微镜图像。自噬体的位置用红色箭头标记。
图7 BXD 对皮下移植的 HCT116 肿瘤生长以及体内肿瘤中铁和 ROS 水平的影响
(A) 在不同时间点测量肿瘤体积。（B, C）计算肿瘤中铁（B）和 ROS（C）的水平。与对照组相比，**P < 0.01。
图8 BXD 对 CRC 作用机制的体内验证
检测肿瘤组织中 LC3 (A)、NCOA4 (B)、GPX4 (C)、PI3K、p-PI3K (D)、FTH1 (E)、AKT、p-AKT (F)、mTOR 和 p-mTOR (G) 的表达。β-Tubulin作对照。与对照组相比，*P < 0.05 和 **P < 0.01。
图9 机制示意图
BXD 通过靶向 PI3K/AKT/mTOR 信号通路促进 CRC 细胞的铁自噬作用，导致细胞内铁超载和 ROS 生成。
【讨论】
本研究采用网络药理学方法探讨了 BXD 在体外和体内对 CRC 的影响机制。由于 BXD 由多种不同的中草药组成，因此成分复杂。通过检索《中国药典》和其他文献，确定了含量较高的六种主要有效成分，并通过高效液相色谱法进行了确认。质量控制分析表明，该系统具有很高的稳定性和可靠性。在后续实验中，对这六种成分的溶液进行了化验，以确定 BXD 的有效成分。
通过网络药理学分析，构建了BXD化合物-治疗靶点网络，获得了146个治疗靶点。随后，根据 PPI 网络，最高程度的靶点包括 AKT1、IL-6、MAPK8、MAPK1、VEGFA、JUN 和 STAT3。结合 GO 和 KEGG 分析，PI3K/AKT 信号轴被确定为 BXD 的主要靶标。PI3K 有三种同工酶，每一种都有独特的结构和功能。PI3KI 是最明确的同工酶，由调节亚基和催化亚基组成异源二聚体。PI3K 由生长因子受体信号激活，作为第二信使通过多种细胞靶点发挥作用。AKT 是一种丝氨酸/苏氨酸激酶，有三种异构体。PI3K 能产生磷脂，并将各种上游细胞因子和生长因子的信号转化为有用的信息，传递给 AKT 及其下游效应途径。AKT 激活对雷帕霉素敏感的 mTOR 复合物 1。PI3K/AKT/mTOR 轴对许多生理和病理过程都至关重要，包括细胞生长、增殖、新陈代谢、蛋白质和脂质合成以及自噬。大量研究证实，PI3K/AKT/mTOR 轴在包括 CRC 在内的多种癌症中被异常激活。目前已开发出多种针对 PI3K/AKT/mTOR 轴的抗 CRC 药物，并被证明有效。基于上述推论，我们设计了体外和体内实验来证实这些实验结果。首先，用 BXD 主要成分的混合物处理 HCT116 细胞，发现细胞的增殖和迁移受到抑制。在体内，BXD 能显著抑制裸鼠皮下异种移植瘤的生长，进一步表明了其抗 CRC 活性。经 BXD 成分混合物处理的 HCT116 细胞中 PI3K、AKT 和 mTOR 的磷酸化程度也有所降低。体内灌胃 BXD 还能显著降低裸鼠 CRC 皮下异种移植瘤中 PI3K、AKT 和 mTOR 的磷酸化水平。
考虑到mTOR直接磷酸化类似于自噬激活激酶1（ULK1）的unc-51，从而抑制自噬，研究人员探讨了BXD对CRC细胞自噬的影响。自噬是一个高度保守的细胞自我分解和新陈代谢过程，在各种应激状态下都会被激活。真核细胞主要通过微自噬、分子伴侣介导的自噬和巨自噬将非必需或潜在毒性物质送入溶酶体进行降解。该过程不仅能提高细胞活力外，还能确保细胞获得充足的能量和营养。根据之前的 CRC 研究，自噬在肿瘤的发生和发展中起着调节作用。在某些情况下，自噬增加了肿瘤细胞的死亡，减少了基因组突变，从而抑制肿瘤。自噬也是肿瘤的一种保护机制，可赋予肿瘤对化疗药物的抗性，延缓肿瘤细胞凋亡。铁自噬是一种新发现的自噬形式，其中铁蛋白复合物在 NCOA4 的控制下通过自噬调节铁的生物利用度。在这一过程中，NCOA4 将铁蛋白运送到溶酶体。缺失 NCOA4 会导致铁蛋白降解损失，从而降低铁在细胞中的生物利用率。然而，NCOA4的过度表达会导致细胞中铁的积累和ROS的产生，最终导致铁死亡。既往临床试验发现，诱导铁死亡可能是治疗多种类型癌症的有效策略。尽管铁自噬在 CRC 启动和进展中的机制有待进一步研究，但一些研究表明，癌细胞中铁死亡的触发会导致铁自噬；因此，增加细胞内游离铁的水平是可行的。我们研究了BXD是否能通过靶向PI3K/AKT/mTOR轴和诱导CRC细胞的铁死亡反应来促进铁自噬。体外和体内实验证实，BXD能提高LC3II与LC3I的比例、NCOA4的水平以及细胞内铁和ROS的水平，表明BXD能促进CRC细胞发生铁自噬。因此，BXD干预可降低体外和体内FTH1和GPX4（二者均为铁死亡明星分子）的水平，表明其能够诱导CRC细胞的铁死亡。
【结论】
BXD 被广泛用于治疗功能性胃肠道疾病、溃疡性结肠炎和其他各种疾病，但有关其治疗 CRC 疗效的证据却很有限。既往研究表明，BXD 参与了抗 CRC 的机制具体涉及细胞凋亡、MAPK 信号通路、晚期糖基化终产物受体（the Receptor of Advanced Glycation Endproducts，RAGE）信号通路以及其他信号通路。然而，目前还没有研究阐明 BXD 通过铁自噬对 CRC 的影响。在本研究中，研究者们确定了 BXD 的主要生物活性成分，并探索了 BXD 的作用机制，并在体外使用了 CRC 细胞模型，在裸鼠皮下使用了 CRC 异位移植模型，以初步确定其作用机制。通常情况下，患者的生药用药剂量通常为70 g/60 kg/天。用于小鼠的剂量是根据体表面积从人体剂量换算而得来的。研究者们发现BXD具有明显的抗癌作用。具体机制如图9所示，BXD 通过靶向 PI3K/AKT/mTOR 信号通路促进铁自噬，导致细胞内铁积累和 ROS 生成增加，并最终导致细胞死亡。此外，研究者们还初步分析和验证了 BXD 主要成分的作用机制，并证实其主要生物活性化合物的混合物在体外产生的效果与 BXD 的效果相当，从而明确了 BXD 的生物活性成分。由于这些实验还只是初步论证，还需要进一步的实验来充分验证这些数据。此外，BXD 作为一种传统天然药物，具有多种疾病治疗靶点，因此，应进一步对其进行详细研究，以确认其在临床实践中的应用潜力。
Wang Y, Zhao T, Huang C, Liu F, Zhang Y, Kong D, Fan Z. Effect and mechanism of Banxia Xiexin decoction in colorectal cancer: A network pharmacology approach. Phytomedicine. 2023 Oct 31;123:155174.
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