王晨童, 周皎琳, 林国乐, 等. 三维培养肿瘤模型在结直肠癌中的研究进展[J]. 中华肿瘤杂志, 2023, 45(6):464-470.
DOI: 10.3760/cma.j.cn112152-20220928-00661.
传统的肿瘤培养模型包括二维肿瘤细胞培养和异种移植物模型，前者存在缺乏肿瘤异质性、模型失真等问题，后者存在建模成功率偏低、耗时长、价格贵等缺点。近年出现的体外三维(3D)培养模型可以较好地模拟体内肿瘤的空间结构与生长环境，保留肿瘤细胞的病理与遗传学特征，并反映肿瘤细胞间、肿瘤与微环境间的复杂相互作用，逐渐成为肿瘤机制研究、药物筛选和肿瘤个体化治疗的有力工具。球状体、类器官、微流控装置等3D肿瘤模型技术日渐成熟，共培养、3D生物打印、气液界面等新技术的应用使模型的仿真性进一步提高，一些模型可重建肿瘤微环境，一些模型甚至具有内源性免疫成分与微脉管系统。近年来，有学者将异种移植物模型与类器官技术相结合，构建了体内/体外配对的生物模型库，发挥出两种技术的优势，并可针对具有特定分子学特征的肿瘤进行个体化精准疗法研发。至今，上述技术已广泛应用于结直肠癌研究领域。作者团队目前研究采用结直肠癌患者来源的3D微肿瘤模型指导术后化疗药物选择，建模成功率高、药物筛选实验结果理想。相信随着相关技术的进步，3D肿瘤模型将在结直肠癌研究、药物研发与转化、疗法筛选及个体化治疗等领域发挥巨大作用。
【关键词】结直肠肿瘤; 体外培养技术; 球状体; 类器官; 芯片实验室装置
结直肠癌(colorectal cancer, CRC)是一种常见的消化道恶性肿瘤，位居我国肿瘤总发病率第2位、总死亡率第5位。尽管早期CRC预后较好，但肿瘤的局部进展和远处转移仍是CRC患者的主要死因。分子遗传学研究显示，CRC是一种具有高度异质性的肿瘤，由染色体不稳定及微卫星不稳定(microsatellite instability, MSI)两大途径导致多种遗传变异而致病。2015年国际CRC分型联盟提出了共识分子亚型，不同分子亚型的CRC对药物具有不同的敏感性，多数晚期CRC患者对一线治疗耐药，从而使个体化精准疗法成为治疗晚期CRC的关键。近10余年来，靶向药物如西妥昔单抗、贝伐单抗已被常规用于伴有远处转移的CRC患者。免疫检查点抑制剂(immune checkpoint inhibitor, ICI)如程序性死亡受体1(programmed death－1, PD－1)单抗等也被证实可使错配修复缺陷/微卫星高度不稳定(microsatellite instability－high, MSI－H)型CRC患者获得显著且持久的肿瘤学疗效。近年来，随着对肿瘤分子学机制认识的深入，针对特定靶点、通路的新药如BRAF抑制剂、MEK抑制剂等亦逐渐进入临床应用，过继性细胞免疫疗法在实体瘤中的临床应用也在兴起，大量新药、新疗法的涌现与其精准、有效地应用于临床之间存在着巨大鸿沟，亟待开发出更加高效并具备准确疗效预测能力的临床前模型。
既往CRC的体外研究主要采用二维(two－dimensional, 2D)肿瘤细胞系和异种移植瘤模型。2D模型既无法模拟体内肿瘤的空间结构与异质性，也无法反映肿瘤细胞之间及肿瘤细胞与肿瘤微环境(tumor microenvironment, TME)间的相互作用。异种移植瘤模型虽可高度模拟肿瘤的结构、异质性及生理环境，但所使用的免疫缺陷小鼠缺乏正常的免疫机能，无法进行肿瘤免疫相关研究与免疫药物的开发，同时存在建模成功率低、实验周期长、价格贵等问题。不同于传统模型，三维(three－dimensional, 3D)培养肿瘤模型是将肿瘤细胞在体外构建成为立体的多细胞聚集体，模拟实体瘤的空间结构与微环境，弥补了既往模型的诸多不足。
目前，发展前景较好的3D肿瘤模型包括球状体、肿瘤类器官和微流控装置等。
肿瘤球状体
1．球状体简介：
肿瘤球状体通常由肿瘤细胞系或新鲜肿瘤组织培养构建，模拟体内肿瘤及复杂的TME，反映肿瘤细胞间、细胞与基质间相互作用，通常不具备脉管系统。球状体分为无支架和有支架两种。无支架球状体的构建方法包括悬挂滴法、悬浮培养、非黏附表面培养等，因其技术相对简单、成本较低，并可实现高通量检测而成为目前最为常用的方法。球状体细胞形成相互联系的空间结构，并可在生长因子的诱导下进一步增殖，产生自己的细胞外基质(extracellular matrix, ECM)。有支架球状体采用水凝胶等支撑材料模拟肿瘤的ECM，可以更加真实地模拟体内肿瘤空间结构及各成分间的相互作用，进一步提高了模型的仿真性。
TME是肿瘤细胞赖以生存、发展的复杂环境，它由肿瘤细胞、免疫细胞、内皮细胞、癌相关成纤维细胞(cancer－associated fibroblast, CAFs)、间充质干细胞在内的细胞成分和ECM、细胞因子等非细胞成分所组成。各成分间相互作用，共同促进肿瘤的增殖与侵袭转移。为更好地模拟TME，先进的肿瘤球状体还会加入基质细胞、免疫细胞等进行共培养。研究显示，共培养可以改变肿瘤细胞中特定信号通路的分子表达，使之更加接近于体内肿瘤。传统球状体大多采用肿瘤细胞系进行构建，近年发展出了采用患者原代肿瘤细胞构建球状体的技术，可为肿瘤个体化治疗提供有力工具。
2．球状体在CRC研究中的应用：
由于较好地保留了实体瘤细胞的形态、理化及遗传学特性，肿瘤球状体被成功用于CRC的分子机制研究。Bagheri等利用CRC细胞系构建的球状体进行研究，结果显示，阿司匹林和LGK974联合用药可抑制CRC细胞的侵袭，促进细胞凋亡，并发现这一作用是通过抑制Wnt和MAPK信号通路、阻断细胞周期而实现的。Vitiello等利用患者源性CRC球状体证实聚腺苷酸二磷酸核糖聚合酶抑制剂(poly－ADP－ribose polymerase inhibitors, PARPi)联合化疗对携带共济失调毛细血管扩张基因突变的CRC具有很好疗效，其中PARPi与伊立替康联用效果最好，从而提出了针对这一突变型CRC的潜在新疗法。此外，肿瘤球状体也被用于转移性CRC的耐药性研究。Sogawa等利用无支架球状体建立了高转移性CRC模型，发现低浓度顺铂对其疗效甚差，甚至促进癌细胞生长，这可能与顺铂诱导的外泌体分泌有关，并发现顺铂、伊马替尼增加了基质金属蛋白酶9启动子活性，虽可杀死部分肿瘤细胞，但会增强剩余癌细胞的侵袭能力。
为进一步提高肿瘤球状体的仿真性，研究人员开发出添加其他细胞成分的共培养球状体。Zoetemelk等采用CRC细胞系、CAFs和内皮细胞构建了一种低成本、可重复的短期共培养球状体，与非共培养相比，该球状体具有更强的耐药性，可更加真实地反映药物疗效。为研究抗血管生成药物，Truelsen等将患者源性CRC细胞、肝转移瘤细胞、人脐静脉内皮细胞和成纤维细胞构建为共培养球状体，初步模拟了肿瘤血管生成的复杂过程，对不同抗血管生成药物的敏感性进行了量化，并证实贝伐单抗等药物是通过抗血管生成而非诱导内皮细胞凋亡来发挥作用。
近年，免疫疗法在肿瘤治疗中取得了显著进展，前景巨大。然而，复杂的肿瘤免疫难以在体外模型中展现，开发真实模拟人体肿瘤免疫微环境的临床前模型被列为2020年免疫治疗十大挑战之首。为此，研究者构建了肿瘤球状体－免疫细胞共培养模型用于CRC的免疫微环境研究。2017年，Herter等首次报道了一种包含结肠癌细胞、成纤维细胞和免疫细胞的共培养球状体模型，检验了两种新型免疫药物肿瘤靶向性融合蛋白IgG－IL2v和肿瘤靶向T细胞双特异性抗体单独和联合应用对肿瘤细胞的杀伤效果，该研究显示，免疫药物通过激活T及自然杀伤(natural killer, NK)细胞导致免疫细胞浸润与活性增高，细胞因子释放增加，使瘤细胞被更快清除。此后，Courau等在无基质和生长因子的培养基中将异体免疫细胞与CRC细胞球状体进行共培养，构建了一种快速、精确、可重复性好的培养模式，他们发现异体T及NK细胞可以在体外快速浸润肿瘤球状体，介导CRC细胞凋亡，破坏球状体结构，而加入免疫刺激因子可以进一步增强对肿瘤细胞的杀伤作用。上述共培养球状体模型均可为免疫治疗药物的体外检测与研究提供试验平台。
尽管球状体技术在研究CRC的侵袭转移、耐药机制及开发靶向特殊通路的新药、新型免疫疗法等方面发挥了重要作用，然而这一技术也具有一定的局限性。首先，肿瘤球状体要具有均匀的大小及可重复性，这对其制作方法提出了较高要求。其次，球状体模型较为简单，其TME与真实状况仍有差距，特别是脉管系统的缺乏在一定程度上限制了其应用。此外，肿瘤球状体尚难实现体外的长期、稳定培养，技术有待进一步完善。
3．我们的临床实践：
本课题组开展的一项前瞻性临床研究中，采用由北京大学未来技术学院席建忠课题组开发的微肿瘤模型进行药物敏感性检测，探讨该技术指导局部进展期CRC患者术后化疗方案选择的可行性与效果，该模型被称为患者源性类肿瘤细胞簇(patient derived tumor－like cell cluster，PTC)，由源自患者肿瘤组织的细胞通过全新的自组装机制凝聚和扩增而成，可较大程度地模拟TME。席教授课题组通过对肿瘤组织及对应的原代肿瘤微球进行转录组测序与对比分析，筛选出维持肿瘤细胞体外代谢、增殖等功能的关键细胞因子及小分子抑制剂，优化了培养基组分，将培养成功率提高至90%，并最大限度地保留了原始肿瘤组织的特征。同时，该模型解决了一系列核心工程技术问题，达到了在短至2周的实验周期内筛选数百甚至上千种药物的技术要求，检测准确性高达93%。我们现有的研究数据表明，PTC模型用于CRC患者术后药物敏感性检测的建模成功率高，指导临床用药选择的效果理想。
类器官
(一)肠道类器官的简介
类器官是近年兴起并备受关注的一种3D培养技术，被评为2017年《自然方法》年度生命科学技术。类器官是由诱导性多能干细胞、胚胎干细胞或成体干细胞自组装形成的一个高度保留原始器官结构及分子特征的细胞团块样组织。2009年，Hans Clevers和Toshiro Sato等人将小肠隐窝中的单个富含亮氨酸重复序列G蛋白偶联受体5+肠干细胞培养于含有表皮生长因子、Noggin和R－spondin(ENR)的三维基质胶培养体系中，培育出第一个"微型肠道"，开启了类器官时代。2011年，该团队又开发出人结肠类器官的长期培养方案，进一步研究发现，此系统同样适用于人CRC类器官的培养，而肿瘤类器官的形成和维持不依赖于ENR的支持。
(二)类器官在CRC研究中的应用
1．遗传学机制研究：
CRC的发生、发展与转移过程中存在一系列复杂的遗传学变异。研究表明，CRC类器官与其亲代肿瘤体细胞突变的相似性可达90%，DNA拷贝数的相关性为0.89，同时在保留亲代肿瘤异质性方面优于球状体。此外，基因编辑技术在类器官中更易实现。
早在类器官建立之初，就有学者利用CRISPR－Cas9基因编辑技术将APC、SMAD4、TP53等抑癌基因及KRAS、PIK3CA等癌基因引入人肠上皮类器官中，结果显示，驱动基因变异是腺瘤向腺癌转变以及CRC细胞转移性生长的必备条件，但CRC的转移还依赖于染色体不稳定等额外的遗传变异。2016年，Fujii等采用不同组织学分级与分子亚型的患者源性肿瘤样本成功构建了包含55个CRC类器官的大型模型库，并开创性地建立了低分化腺癌、黏液腺癌及神经内分泌癌等罕见亚型CRC类器官，该研究表明，在腺瘤到腺癌的演进过程中细胞逐渐出现了生态位非依赖性生长，而罕见亚型CRC则仍表现出对生态位的依赖。
为研究转移机制，研究者采用源自同一CRC患者的原发瘤及肝转移瘤分别构建类器官，结果显示转移瘤类器官具有更强的生长与转移能力，转录组学揭示了转移过程中发生改变的标志性信号通路，如SOX2基因高表达与CRC肝转移相关。
2．高通量疗法筛选及个体化治疗：
2015年，van等首先报道成功将患者来源类器官(patients derived organoids, PDO)用于CRC的高通量药物筛选，研究者利用源自20例患者的CRC类器官库对83种药物进行了筛选，结果显示，TP53缺失的类器官对MDM2抑制剂耐药，RAS突变的类器官对表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor, EGFR)抑制剂不敏感，特别发现的结果为1例携带RNF43突变(而非APC突变)的类器官对豪猪酶抑制剂高度敏感。这一研究成功展示了肿瘤类器官在基于分子学基础的药物研究中的重要价值，特别是在针对罕见亚型CRC的特殊分子靶点进行新药研究时，PDO可以发挥重要作用。2018年，Vlachogiannis等报道采用转移灶活检标本成功构建了16例转移性CRC的PDO模型库，体外测试对瑞戈非尼和西妥昔单抗等药物的反应，疗效预测的敏感度与特异度分别高达100%与93%。总之，PDO技术可以实现CRC的体外高通量疗法筛选，准确预测临床疗效并指导个体化治疗。
3．在类器官中引入TME：
肿瘤类器官通常仅包含上皮来源的癌细胞，TME依赖于人为构建。一些如MSI－H、BRAF突变型、低分化、黏液腺癌等少见类型CRC由于对TME具有高度的依赖性而较难成功构建类器官。为此，研究者将CAFs、免疫细胞等TME成分与类器官进行共培养，取得了一定进展。
CAFs是TME的主要组分之一。CAFs分泌刺激信号以支持肿瘤发展、抑制免疫并促进耐药性的产生。有学者将患者源性CAFs与CRC的PDO进行共培养，发现在不添加PDO培养常用生长因子的条件下肿瘤依然可以持续增殖；同时，对共培养模型的基因表达谱和富集分析发现，在非共培养模型中所缺失的免疫应答相关通路被重新激活，显示TME成分的引入提高了模型的仿真性。
近年来免疫疗法的兴起使开发患者特异性免疫－肿瘤学体外模型成为热点。2018年，Dijkstra等将来自于CRC患者的PDO与同源性外周血淋巴细胞进行共培养，构建出患者个体化类器官平台，成功从MSI－H型患者外周血中富集了肿瘤反应性T细胞，证实了其对同源PDO的杀伤性。这不仅实现了在微创条件下动态评估患者个体化免疫治疗的疗效，还为利用外周血开展过继性T细胞疗法提供了可能。而对于免疫原性较弱却占比更高的微卫星稳定型CRC，嵌合抗原受体(chimeric antigen receptor, CAR)细胞疗法被寄予厚望。2018年，Schnalzger等报道了一个CRC类器官与CAR－NK细胞共培养平台，可动态、定量监测CAR介导的细胞毒性反应，展示了CAR细胞对肿瘤特异性抗原的靶向作用，证明其在仅有微量肿瘤抗原表达或存在复杂微环境的条件下依然可以特异性地杀伤肿瘤细胞，展现了CAR疗法的广阔前景。此外，为全面引入内源性肿瘤免疫微环境，Neal等通过一种气液界面法，将患者来源肿瘤组织机械切割后培养于气液界面系统，构建出包含肿瘤固有基质的类器官模型，使肿瘤细胞与T、B、NK及巨噬细胞等天然嵌入的免疫细胞得以共培养，模型内的肿瘤浸润性淋巴细胞(tumor infiltrating lymphocyte, TILs)准确保留了其来源肿瘤的T细胞受体谱，利用这一模型，研究者成功模拟了抗PD－1免疫治疗，观察到与体内一致的肿瘤抗原特异性TILs活化及细胞毒性反应。该模型成功模拟了TME的内在免疫成分而非外周血免疫细胞的治疗应答，而这被认为是研究ICI作用机制的关键。
与球状体相比，肿瘤类器官高度复杂，具有更加接近体内肿瘤的细胞组成、形态结构、理化及遗传特征，更加适用于生物转染，并可在体外稳定培养更长时间，为高通量药物敏感性研究、个性化精准治疗和生物库的建立奠定了基础。局限性方面，CRC类器官的培育成功率尚不理想，特别是对于仅能通过活检获取癌组织的转移性CRC，建模成功率仅有约70%。此外，可重复性偏低以及缺乏脉管系统等问题尚待进一步解决。
4．类器官与人源肿瘤异种移植(patient derived tumor xenograft, PDX)技术的联合应用：
2015年，加拿大学者成功构建了患者源性胰腺导管腺癌类器官，这一体外3D模型表现出与亲代肿瘤相近的组织学结构、分化状态以及表型异质性，即所谓的组织稳态，学者将类器官注射于免疫缺陷小鼠皮下，构建出与亲代人体肿瘤组织学结构近似的PDX模型，并利用这一PDX模型再次培养出胰腺癌类器官。2018年，荷兰学者将鼠或人源性CRC类器官经手术方式植入免疫缺陷小鼠的盲肠上皮，构建了一种常规位移植的PDX模型，该模型可在体内环境中实时、动态地观察与研究CRC的自然发展与转移规律。2018年，美国学者从已有的LuCaP前列腺癌PDX库中选取20个模型，构建了PDX来源的类器官模型(PDX－derived organoid, PDXO)，使具有不同组织学及遗传学特征的肿瘤在体外被有效扩增，为研究前列腺癌发病机制、治疗反应及其内在的分子学相关性提供了一个广阔而具有明确遗传学特征的平台。如今，研究人员已在包括乳腺癌、CRC、肺癌等多瘤种中建成了PDX生物模型库，在此基础上可相应构建出高保真、高通量的PDXO模型库，生成匹配的体内/体外模型对，这类复合平台忠实地模拟了亲代人体肿瘤，既可实现体外高通量药物试验，又可实现体内验证与疗法完善。特别是模型均具有明确已知的分子遗传学特征，可实现针对特定类型肿瘤所进行的个体化疗法研究。经济高效的研究平台将助力加速抗肿瘤药物的研发与转化。
3D肿瘤模型新技术
1．3D生物打印技术：
随着组织工程学的进步，研究人员运用3D生物打印技术，将肿瘤细胞掺入"生物墨水"，在计算机辅助设计下构建出组织结构更为复杂的3D肿瘤模型。这一技术既可以将计算机设计的仿生模型精确地呈现出来，又可以设计添加多种细胞、生物材料以及生物活性分子，模仿体内肿瘤复杂的结构、异质性及TME，具有可定制、可复制、标准化水平高等优点。
近年来，我国学者利用3D打印技术制作生物支架，将HCT116人结肠癌细胞、CAFs和肿瘤相关内皮细胞植入支架内，成功构建了3D共培养结肠癌模型，该研究显示，3D支架不仅为细胞提供了良好支撑，并可在维持细胞黏附、增殖、干性保持及血管化等生理过程中发挥作用；模型中活化的基质细胞高表达多种肿瘤相关因子并重塑ECM，肿瘤组织也表现出与体内肿瘤极为相似的转录组学特征。近期，Sbirkov等采用Caco－2人结肠癌细胞成功构建了一种价格适中的新型3D打印模型，模型中Caco－2细胞呈现出更加真实的腺体样组织学形态，同时RNA表达谱呈现出细胞黏附、低氧、EGFR/KRAS相关通路基因上调而细胞周期调控相关基因下调的特点。化疗药测试实验显示，与2D培养物相比，3D打印模型中肿瘤细胞的总体耐药性增加，更接近于体内肿瘤的药物反应性，此外，研究人员表示该平台还可被拓展到原代CRC样本，使之有望成为新型的个体化药物筛选平台。
2．微流控装置：
微流控装置是在精密加工、生物材料、组织工程等技术基础上将生物样本制备、反应、分离、检测等基本单元集成到微米级芯片上，可精确操控微小流体经微细通道流动于不同隔室之间，并可实现自动检测与分析的技术平台。微流控装置可利用同一平台培养多种细胞、器官与组织，精确控制各组分的量、布局与空间联系，设定微流体的组分，在与球状体、类器官等技术相结合后，可构建出复杂精密而功能强大的体外3D模型，同时具有高通量、可定制、样本用量小、高效率等特点。微流控装置不仅可以重建复杂的TME，其突出的优势在于可以模拟微脉管系统，弥补了前述3D模型的不足。
Carvalho等开发了一种仿生CRC微流控芯片，将HCT116人结肠癌细胞加入基质胶作为肿瘤核心，并以人结肠微血管内皮细胞成功构建出脉管支持网络。学者应用这一芯片评估了携带荧光标记的纳米药物在3D肿瘤球中的分布、递送效率及对肿瘤细胞的杀伤情况，模拟出真实肿瘤中药物浓度梯度与药效的相关性，此外，作者团队还成功将芯片中培养的肿瘤细胞提取出来，进行遗传学检测与机制研究。然而，微流控平台的读数与检测分析通常会破坏原有模型，并需要额外的泵系统提供动态微环境。为解决这一问题，Wang等开发了一种基于重力流的非接触模型系统，结合数字传感技术，实现了体外3D CRC类肿瘤培养以及对肿瘤细胞增殖、代谢以及环境酸碱度的无创监测。与静态3D模型相比，这一动态模型构建了更加仿真的TME，增强了肿瘤干细胞特性并增加了促肿瘤细胞因子的分泌，模型内肿瘤细胞对标准化疗方案的耐药性也更强，显示出在药物筛选与肿瘤个体化治疗中广阔的应用前景。
此外，微流控装置也在肿瘤转移研究中发挥优势。国外学者构建了一种由多个生物工程类器官组成的多部位转移瘤芯片，具有多个特异性隔室，分别放置CRC细胞株、肝、肺及内皮细胞等类器官，各隔室通过循环液体相互连接，并通过荧光成像技术对细胞进行追踪。研究显示，CRC细胞优先归巢入肝、肺隔室，这与临床上CRC的常见转移部位相吻合，显示了此模型在抗肿瘤转移药物研究方面的具大潜力。
近年还出现了整合免疫成分的免疫功能性肿瘤芯片(immunocompetent cancer－on－chip, iCoC)。先进的iCoC包含人肿瘤球状体或类器官、ECM、免疫细胞及因子、自组装微脉管系统等。模型TME中的各种参数可被精细调控，从而更加真实地模拟人肿瘤细胞与免疫成分间复杂的相互作用与动态变化。目前，iCoC已被成功用于包括ICI在内的多种免疫疗法研究。
3．各种常见肿瘤模型间的比较
各种常见肿瘤模型之间的比较见表1。
结语
3D培养肿瘤模型模拟真实的肿瘤空间结构、理化特性及遗传表型，更好地反映肿瘤细胞与其微环境间的复杂相互作用。随着技术不断进步，从相对简单的肿瘤球状体到更为复杂且仿真的肿瘤类器官，从利用肿瘤细胞系到采用患者源性肿瘤组织，实现了个体化模型的构建，通过共培养、气液界面等技术构建出复杂的TME，特别是各种免疫成分的引入使在体外模型中难以实现的免疫疗法研究成为了可能。如今，包括靶向特殊耐药通路、新型免疫治疗药物在内的新型疗法大量涌现与其安全、有效地应用于临床之间存在巨大鸿沟，亟待加速临床转化。3D肿瘤模型必将成为CRC研究领域的重要临床前模型，在包括新疗法开发、临床转化、药物筛选、个体化治疗等方面发挥巨大作用。
免责声明本文仅供专业人士参看，文中内容仅代表中华肿瘤杂志立场与观点，不代表肿瘤资讯平台意见，且肿瘤资讯并不承担任何连带责任。若有任何侵权问题，请联系删除。
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