急性髓系白血病（AML）是成人中最常见的急性白血病，具有高度异质性，其发生发展通常涉及多个组学的变化。存在于体液中的非编码小RNA（sncRNA）是重要的调节分子，被认为是有前景的非侵入性疾病临床诊断生物标志物。然而，AML患者血清和骨髓上清液中的sncRNA表达模式以及变化特征尚未被阐明。近日，陆军军医大学第二附属医院（新桥医院）血液病医学中心张云芳教授、陆军军医大学新桥医院张曦教授及其团队于Theranostics（IF=11.600）期刊上发表相关研究报告，综合分析了AML患者血液和骨髓中循环sncRNA的表达模式，及其在健康对照组和AML患者中的变化特征，为sncRNA在AML中的作用提供了深入见解。
研究背景
sncRNA，包括MicroRNA（miRNA）、tRNA衍生的小RNA（tsRNA）、rRNA衍生的小RNA（rsRNA）、YRNA衍生的小RNAs（ysRNA），是重要的调节分子，可调节mRNA稳定性、翻译效率和核糖体生物生成的多个方面。据报道，在乳腺癌和肝癌等疾病中，血液miRNA存在失调现象。常见的量化血液sncRNA的方法是使用miRNA阵列或核苷酸长度在18~30个核苷酸范围内的小RNA测序，但在测序过程中会导致更大核苷酸长度的小RNA数据丢失，如piRNA（~30个核苷酸）、tsRNA（29~34个核苷酸）和rsRNA（> 30个核苷酸）。
通过将核苷酸长度扩展到45 nt，本文研究人员既往已报道了tsRNA在脊椎动物血液中以稳定的形式高度富集，并且在从鱼类到人类的不同物种中均有所保存。在小鼠和猴子注射脂多糖（LPS）诱导急性炎症后，以及人类感染乙型肝炎病毒（HBV）后，tsRNA的血液浓度发生变化，提示其在炎症反应中发挥作用。
AML具有异质性突变拓扑结构，并涉及不同的非编码RNA改变。近年来，miRNA在AML中的作用得到了广泛的研究，且在白血病中已经区分出了miRNA的明确表达谱。
由于循环miRNA具有敏感性、稳定性和非侵入性等吸引人的优势，许多研究报告称循环miRNA可以作为一类新型的非侵入性诊断和预后生物标志物，在多种癌症中具有良好的临床应用前景。然而，这些研究大多集中在miRNA上，对血清中其他类型的循环sncRNA的研究却很少。因此，在本研究中，研究者对来自80例新诊断、未经治疗AML患者的122份血液和骨髓样本中的sncRNA进行了检测，以量化sncRNA，探索其在AML生物学中的潜在作用，并验证在AML辅助诊断中循环sncRNA的特异性改变模式能否作为非侵入性生物标志物。
研究设计
该研究检测了80例新诊断、未经治疗的AML患者和12名健康对照者的血液和骨髓样本，并进行高通量小RNA测序。通过对差异表达的sncRNA进行分析，以揭示AML患者和对照组之间的不同表达模式。通过使用机器学习方法来评估特定sncRNA在区分AML患者和健康对照者中的能力和效率。通过RT-PCR、Q-PCR和NB方法评估单个sncRNA表达水平的改变。通过相关性分析评估血清和骨髓上清液之间的sncRNA表达模式。
研究结果
在人血清中鉴定了超过20种类型的除miRNA之外的sncRNA
为了克服以往非编码小RNA检测方法中存在的局限性，研究者将小RNA测序长度范围扩展到15-45nt，通过进一步优化非编码小RNA注释体系，我们发现人类血清中有超过20种不同类型的非编码小RNA。除了miRNA以外，血清中还包括大量的tsRNA、rsRNA、ysRNA、piRNA、antisense、lincRNA、snRNA、snRNA等（图1A）。有趣的是，血清中含量最高的sncRNA不是miRNA，而是rsRNA，约占总sncRNA的62.86%。之前有报道称tsRNA在脊椎动物血清中富集，在本文研究中，我们发现人血清中含有相当比例的tsRNA（平均约占4.22%）。此外，人血清中还发现了相当数量的ysRNA，平均占14.97%（图1B）。总体来说，rsRNA、tsRNA和ysRNA的水平占总sncRNA的80%以上，而piRNA和其他sncRNA的水平占其余的15%。piRNA、反义RNA和lincRNA衍生的小RNA在人类PBS中的比例相当低，低于8%，其他类型的小RNA在PBS中的比例总计为7.33%。
图1. 健康人外周血清（PBS）中的非编码小RNA图谱
rsRNA和ysRNA在人类PBS中占主导地位，且分布特征明显
由于细胞中存在大量的rRNA，因此多数研究将rsRNA看作是rRNA产生的碎片，从而被忽视。然而，Zhang等人发现，在生理条件下28S rRNA衍生的rsRNA在小鼠成熟精子中富集，并在LPS感染后在多个组织中增加，这表明rsRNA可能参与了活动性感染引发的机体防御机制。本研究发现，除了miRNA，我们发现了人血清中含有丰富的rsRNA，占总体60%以上（图1A）。通过对这些rsRNA的来源进行分析，我们进一步将rsRNA分为细胞核编码的rsRNA（cyto-rsRNA-5S/5.8S/18S/28S/45S）和线粒体编码的rsRNA（mt-rsRNA-12S/16S）（图2A）。系统分析表明，28S-rsRNA（88%）和18S-rsRNA（10%）占总rsRNA的98%以上。此外，通过对不同种类rsRNA的序列进行定位，我们发现不同rsRNA序列起源和分布模式大不相同（图2B）。举例来说，cyto-rsRNA-18S具有四个主要表达峰值，分别分布在rRNA-18S序列的674-692（#1）、897-919（#2）、1194-1223（#3）和1838-1862（#4）位置（图2B-C）。rRNA-28S有三个主要表达峰值，它们分布在rRNA-28S序列的1336-1355（#1）、1963-1982（#2）和2895-2920（#3）的位置（图2B和图2D）。
人类YRNA（又称RNY）是一组核苷酸长度范围为83~113 nt的非编码RNA，最初在系统性红斑狼疮中被描述。人类YRNA家族中有四个成员，即RNY1、RNY3、RNY4和RNY5，它们可以被RNsase1切割产生ysRNA。研究表明，人类的细胞外，如血清、血浆和其他生物液体中大量存在ysRNA。在这项研究中，研究者发现了丰富的ysRNA，其中大多数ysRNA来自YRNA的5'端，核苷酸长度约为30 nt（图1B和图2E）。通过Northern Blot验证表明，与ysRNY1、ysRNY3和ysRNY5相比，ysRNY4在血清中显示出更高的表达水平（图2F）。
图2. 健康人PBS中rsRNA和ysRNA产生位点的特征
人血清中tsRNA表达模式的综合分析
tsRNA，也称为tRFs，参与细胞和组织的应激反应、蛋白质翻译调控、肿瘤发生、干细胞生物学、核糖体生物合成、转座子调控、表观遗传调控、凋亡抑制、免疫反应等。近期研究表明，tsRNA参与人类生理和病理过程，可作为多种疾病诊断的生物标记物。在健康人血清中鉴定的tsRNA含量与miRNA相当（图1A）。根据序列注释和成熟tRNA上的主要切割位点（主要由ANG、Dicer、RNaseZ和RNaseP等酶介导），tsRNA可分为三大不同类别，即5'tsRNA、inner'tsRNA和3'tsRNA（图3A）。考虑到在实际检测过程中，无论是RT-PCR还是Northern Blot都很难区分带有或不带有CCA尾的3'tsRNA，因此我们将带有或不带有CCA尾的tsRNA组合为一组，即3'tsRNA。数据表明，胞质tRNA来源的tsRNA（cyto-tsRNA）主要是由5'tRNA组成，占总cyto-tRNA的70%，如cyto-5'tsRNAGlu和cyto-5'tsRNASer（图3B）。然而，与胞质tRNA截然不同的是，线粒体tRNA来源的tsRNA（mt-tsRNA）在很大程度上倾向于生成inner'tsRNA，占总tsRNA非常小的部分，约0.54%（图3B-C）。研究人员还发现不同的tRNA，包括cyto-tRNA和mt-tRNA，在产生不同的tsRNA（图3D-G）。例如，cyto-tRNA-Gly产生5'tsRNA，而cyto-tRNA-Arg、cyto-tRNA-Ser和cyto-tRNA-Thr产生inner'tsRNA或3't sRNA（图3F-H），这可能与RNA酶特异性识别位点和tRNA上不同位点的修饰以及修饰状态有关。
为了比较不同类别的非编码小RNA在血清中的表达丰度，我们随机挑选了每一个种类里相对表达较高的小RNA。值得注意的是，RT-PCR显示rsRNA-28S#3、5'cyto-tsRNA-Gly-CCC、5'ysRNA-RNY4的表达水平显著高于miRNA，表明血清中含有相当或高于miRNA表达丰度的其它种类非编码小RNA。（图3I-J）。它们在人血清中的高度富集也可能表明在人类病理生理学过程中的关键作用。
图3. tsRNA在健康人PBS中的表达模式
循环小RNA在 AML患者与对照组之间的差异很大
为了进一步了解人类循环sncRNA的全面表达谱，并生成AML患者血清sncRNA的高可信度指纹图谱，本研究招募了50例新诊断AML患者，并收集血清进行sncRNA测序。与既往描述的健康对照者的循环sncRNA图谱一致，AML患者的血清中富集了超过20多种非编码小RNA，rsRNA、tsRNA、ysRNA和miRNA仍然是血清中非编码小RNA的主要类型（图4A）。然而，AML患者的血清中大多数非编码小RNA表现出显著的表达变异。总体上来说，随着rsRNA的减少，miRNA、tsRNA和ysRNA的总体比例显著增加（图4B）。研究人员发现179个miRNA（38%）被上调，63个miRNA（13%）被下调（图4C-D）。对于tsRNA来说，与健康对照着相似，AML患者的血清中，5'cyto-tsRNA仍然占主导地位。然而，不同的是，在AML患者的血清中，tsRNA不同氨基酸、反密码子和同受体之间存在显著变化（图4E-G）。其中，我们检测并验证在AML患者的血清中cyto-5'tsRNA-Gly、cyto-inner'-tsRNA-Leu、cyto-5'tsRNA-Lys、cyto-inner'-tsRNA-Val和cyto-inner'-tsRNA-Cys的表达水平显著增加。与正常人相比，AML患者血清中ysRNA总体显著增加，主要由ysRNA4和ysRNA5的增加引起（图4H-K）。与其他类型的非编码小RNA不同，AML患者血清中，rsRNA表现出显著的表达减少和微弱的rsRNA比例改变（图4L-M），例如cyto-rsRNA-18S（#3）的显著上调，cyto-rsRNA-28S（#3）的显著降低（图4N-O）。AML患者循环sncRNA的这种动态失调提示了潜在的诊断应用价值。
图4. AML患者的sncRNA变化特征
基于tsRNA的特征筛选能够将AML受试者与对照组区分开来
为了评估人类循环非编码小RNA在临床应用中辅助诊断的潜力，研究人员使用机器学习方法用于开发基于非编码小RNA数据集的分类器（图5A）。数据表明，在发现和验证队列中，与miRNA相比，较少的tsRNA特征在区分AML患者和对照组方面表现更好（图5B-C）。这些发现表明，基于tsRNA的特征筛选信号能够能够有效地将AML患者与对照组区分开来。基于细胞遗传学和分子异常，AML患者被分为低危、中危和高危组，研究人员发现诊断时某些sncRNA（tsRNA和miRNA）的水平与风险水平密切相关。例如，高水平的tsRNA-Ala-TGC、tsRNA-Leu-CAA和tsRNA-Gly-GCC与中等或不良预后相关，表明血清tsRNA也可能与AML的进展和预后密切相关（图5D）。
图5. 基于tsRNA的特征筛选能够将AML受试者与对照组区分开来
协调血液和骨髓样本之间的sncRNA信号
在临床实践中，骨髓穿刺通常被用作血液系统疾病的诊断方法，然而，其作为一种侵入性操作，导致患者遭受生理和心理上的痛苦。之前的研究表明，通过细胞遗传学方面的分析发现，初诊的AML患者的外周血和骨髓之间存在相当大的一致性。为了研究血清和骨髓上清中非编码小RNA谱是否存在相似性，研究人员收集30例初诊的AML患者的配对的血清和骨髓上清，并生成了60个配对的sncRNA-seq数据集（图6A）。有趣的是，来自个体AML患者的PBS和骨髓上清液（BMS）中的sncRNA谱似乎非常一致。结果显示AML病人血清和骨髓上清中每种非编码小RNA总表达水平没有显著差异（图6B-C）。此外，各种类型的sncRNA，特别是miRNA、tsRNA、rsRNA和ysRNA也获得了相同的结果。重要的是，能够区分AML患者和健康对照组的6种tsRNA（tsRNA-Ala-TGC、tsRNAGly-CCC、tsRNALeu-CAG、tsRNALeu-CAA和tsRNALys-TTT）的表达模式在PBS和BMS之间表现出明显的一致性（图6D）。这些结果表明，AML患者的PBS和BMS具有高度一致的sncRNA特征，并表明PBS和BMS中的循环sncRNA可能有助于塑造白血病的微环境，促进白血病的发生。
图6. AML患者外周血和骨髓中sncRNA表达水平的相关性分析
研究结论
AML在分子和临床水平上是一种高度异质性的疾病，通常由逐渐积累的突变、大量额外的遗传和表观遗传异常以及转录后和翻译调节因子改变引起。sncRNA，特别是miRNA，在维持造血干细胞稳态中发挥着重要作用，并且在白血病进展、转移和耐药性中得到充分证明。过去几十年的许多研究已经确定了非典型sncRNA，如tsRNA、rsRNA和ysRNA，并揭示了它们在细胞稳态和疾病中的多种作用。本研究首次全面描述了AML患者和非AML患者血清和骨髓上清液的sncRNA表达谱，并揭示了AML中特定的sncRNA表达谱。许多针对sncRNA的早期研究旨在发现~ 20nt的miRNA（21~ 23nt）和siRNA（20~ 27nt），使用的是< 30nt RNA的核苷酸长度进行检测，阻碍了sncRNA>30nt的发现，如piRNA（21~35nt）和tsRNA（30~40nt）。在这项研究中，选择了15~45 nt范围内的RNA进行测序，这可以覆盖许多sncRNA。令人鼓舞的是，本研究发现在血液和骨髓中都存在超过20种生物类型的sncRNA。此外，通过描述它们的表达水平、特征分布和来源认证，研究者发现rsRNA是人血清中最丰富的sncRNA，并且主要来源于18s-rRNA和28s-rRNA。本研究还鉴定了tsRNA和ysRNA在人血清中的表达模式，它们主要来源于其亲代tRNA的5'端。这与其他报道一致，即5'tsRNA在细胞中普遍表达且相对稳定。这种完整的sncRNA图谱表明，除了miRNA之外，其他血清富含的sncRNA（例如，tsRNA、rsRNA和ysRNA）也可能参与白血病的发生、发展和发病机理。总的来说，本研究提供了健康参与者和AML患者血液和骨髓中sncRNA的详尽分类，这是阐明其基本功能的先决条件。
通过筛选健康参与者和AML患者的sncRNA，并通过多种技术（qPCR、RT-qPCR和northern blot）进行验证，可以发现大多数血清sncRNA的种类和来源没有明显变化。血清tsRNA和ysRNA呈现均匀的长度分布和5 '端优势，表明了其保守的生物学过程。然而，在AML患者中检测到各种sncRNA的表达量显著改变，例如cyto-5'tsRNA-Gly、cyto-inner'tsRNA-Leu、cyto-5'tsRNA-Lys、cyto5'tsRNA-Cys、ysRNA-RNY4和ysRNA-RNY5，表明血清sncRNAs由于裂解酶（例如ANG、Dicer、RNaseZ和RNaseP）的活性及其包含的修饰（例如m7G、m6A、m5C）而经历了重塑。越来越多的证据表明，在不同修饰酶催化下的转录后修饰是必要的，并影响tRNA生物学的各个方面。异常的修饰状态既可以影响密码子解码，也可以影响tsRNA的生成，这足以促进癌症的发生。因此，本研究也间接表明，在AML患者中发生表观组学变化，这可能是癌细胞高度增殖和代谢状态的结果。
一般而言，与miRNA（3'-羟基和5'-磷酸）相比，tsRNA和rsRNA的特征在于多重RNA修饰和非标准的3'和5'末端，这将阻断接头连接过程并干扰cDNA文库构建过程中的逆转录。为了克服这些问题，本文研究团队最近建立了一种新的对tsRNA和rsRNA友好的sncRNA测序方法（PNDORA-Seq、AQRNA-Seq和CPA-Seq），这扩大了对小鼠组织和人类ES细胞中sncRNA的重述的认识。然而，这些方法的应用需要大量的RNA。研究者相信，未来超微量RNA建库方法的发展和应用将进一步改善临床诊断。
最近研究表明sncRNA与多种疾病存在关联，并通过多种途径调节白血病细胞的生长和转移。虽然sncRNA大多数的功能仍然知之甚少，但其作为疾病诊断和预后的生物标志物的能力已在临床研究中得到揭示。在本研究中，通过应用高效的机器学习方法进行分类，发现某些sncRNA组合（如tsRNA和miRNA）可以有效区分健康对照组和AML患者。此外，本研究结果表明，tsRNA在人血清中的水平相当高，甚至高于miRNA，这表明其可作为一种可测量的生物标志物。除了miRNA和tsRNA之外，ysRNA和rsRNA在总体比例上显示出明显的失调。然而，在本研究中没有使用ysRNA和rsRNA建模，原因有二：首先，它们的序列相似度较高。通过多序列比对，发现优势表达的ysRNAs-5'ysRNA，特别是由RNY1、RNY3和RNY4产生的，共享70%以上的核苷酸。虽然这些序列可以很容易地通过sncRNA-seq分离，但在临床上通过qRT-PCR、RT-PCR或northern blotting检测时，它们很难被区分出来。其次，它们具有复杂的分布特征。与miRNA、tsRNA或ysRNA不同，rsRNA通常会产生一个以上的主峰（如28S-rRNA或18S-rRNA），并且每个rsRNA峰具有很宽的序列长度（15~45 nt），这使得很难在临床应用中精确定位和量化目标rsRNA的水平。
对患者预后的早期评估可以大大提高患者的生存率。实体瘤患者血清中的特异性sncRNA对于恶性肿瘤的病理诊断、恶性程度评估、疗效评价和预后预测具有重要价值。对AML患者的研究结果表明，诊断时部分tsRNA的表达水平与预后相关。此外，本研究进一步分析了tsRNA水平与临床和生物学特征之间的相关性，如成髓细胞的数量。遗憾的是，没有发现显著的相关性，这表明在这项研究中发现的sncRNA也可能是由炎症/代谢的生理变化、肿瘤微环境或白血病生长的结果产生的。此外，本研究的样本量相对较少（n=122），这限制了研究人员更好地阐明tsRNA水平和临床特征之间的相关性，这将在下一个项目中通过扩大样本来进一步探索，同时也将探讨tsRNA在AML中的具体功能。
血液肿瘤通常产生于骨髓，随后异常血细胞不受控制地生长，干扰正常血细胞的正常功能，并打破骨髓血液屏障，导致不成熟的血细胞离开骨髓进入外周血。在临床上，骨髓穿刺检查尽管具有侵入性，但通常被作为血液肿瘤的诊断的金标准，尤其是急性髓系白血病。研究表明，新诊断AML患者的血液和骨髓在形态学特征、细胞化学、免疫表型和白血病标志物表达方面具有一致性。因此，如果外周血可以像骨髓一样发挥作用，那么使用外周血进行研究将会更加方便。在本研究中，对配对的原发性AML血液和骨髓样本进行sncRNA分析，能够发现其相似性和多样性。通过对现有数据的综合分析，发现在骨髓中检测到的大多数sncRNA（包括sncRNA的类型和表达水平）也同样可以在血液中检测到。大量sncRNA在血液和骨髓中表现出较强的相关性（miRNA为0.80，tsRNA为0.67，ysRNA为0.90，rsRNA为0.66）。然而，antisense和lincRNA来源的sncRNA表达丰度并不存在显著相关性。这一结果表明，antisense和lincRNA来源的sncRNA可能是组织特异性的，这可能与骨髓微环境有关，并在调控造血方面具有关键作用。总的来说，本研究的发现具有广泛的意义，并适用于评估AML中的骨髓代谢和肿瘤微环境研究，因为血液中的sncRNA显示与骨髓呈正相关，并且可以以非侵入性方式收集。
研究结论
这项研究描述了人类循环sncRNA的全面特征，以及它们在健康对照组和AML患者中的变化特征，可能有助于识别参与白血病生物学、预后和耐药性的新的关键sncRNA。此外，研究还发现tRNA来源的tsRNA在急性髓系白血病辅助诊断中的潜在应用价值，为急性髓系白血病用药指导、疾病进程监测以及预后判断相关研究打开了新方向。
作者介绍
陆军军医大学新桥医院血液病医学中心博士后郭焕平、陆军军医大学新桥医院血液病医学中心博士后夏琳以及陆军军医大学新桥医院血液病医学中心实验员徐薇为该论文的并列第一作者。陆军军医大学第二附属医院（新桥医院）血液病医学中心张云芳教授、张曦教授团队为该论文的共同通讯作者。
长江学者特聘教授
陆军军医大学新桥医院血液病医学中心主 任
中国人民解放军血液病中心主 任
中国血液病专科联盟副理事长
中华医学会血液学分会常务委员、造血干细胞应用学组副组长
中国医师协会血液科医师分会常务委员
中国抗癌协会血液肿瘤专委会常务委员
中国病理生理学会实验血液学专委会常务委员
第五、六届重庆市医学会血液病专委会主任委员
主持国家、省部级课题 39 项；SCI论文 81篇，最高IF 44.5；主编/副主编 5 部；第一完成人获国家科技进步二等奖1 项，中华医学科技一等奖和重庆市科技进步一等奖、二等奖各1 项；执笔行业指南4项，参编24项；获国家发明专利 32 项
获中国肿瘤青年科学家奖、重庆市首席专家工作室和重庆市创新群体领衔专家、重庆市首席医学专家、重庆市科技创新领军人才、天府学者特聘专家、全军拔尖人才、首批陆军科技英才；JHO，Leukemia、Science Bulletin等编委和审稿专家
Lin Xia, Huanping Guo, Xiao Wu, et al; Human circulating small non-coding RNA signature as a non-invasive biomarker in clinical diagnosis of acute myeloid leukaemia; Theranostics; 2023; 13(4): 1289-1301. doi: 10.7150/thno.80054
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